[發明專利]用于表征藥物產品雜質的系統和方法

在審

• 申請號: 201980007256.6
• 申請日: 2019-01-28
• 公開（公告）號: CN111655722A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 王順海
• 申請（專利權）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00
• 代理公司: 北京市君合律師事務所 11517
• 代理人: 黃遵玲;顧云峰

提供了用于表征蛋白藥物產品雜質的尺寸和電荷變體的系統和方法。

技術領域

本發明總體上涉及蛋白分離方法和細胞培養方法。

背景技術

在過去的二十年，單克隆抗體(mAb)已成功地用于靶向寬范圍的治療領域(WalshG.,Biopharmaceutical benchmarks 2014,Nature biotechnology 2014；32:992-1000；Lawrence S.Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.Naturebiotechnology 2007；25:380-2)。

抗體的異質性是本領域已知的。例如，低分子量(LMW)物質和高分子量(HMW)物質都是促成mAb產品的尺寸異質性的產品相關雜質的例子。由蛋白聚集導致的治療性mAb藥物產品中的HMW物質的形成可能潛在地損害藥物效力和安全性。蛋白水解片段也可能促成產品的雜質分布。

盡管mAb具有由兩條二硫鍵連接的重鏈組成的保守共價異四聚體結構(每條重鏈通過二硫鍵與輕鏈共價連接)，但是這些蛋白經常含有低水平的產品相關雜質，即使在大量純化步驟以后。低分子量(LMW)物質(例如，Fab片段和沒有Fab臂的單體)和高分子量(HMW)物質(例如，mAb三聚體和mAb二聚體)都是促成mAb產品的尺寸異質性的產品相關雜質的例子。由蛋白聚集導致的治療性mAb藥物產品中HMW物質的形成可能潛在地損害藥物效力和安全性(例如，引起不希望的免疫原性應答)(Rosenberg AS.Effects of proteinaggregates:an immunologic perspective.The AAPS journal 2006；8:E501-7；MoussaEM,Panchal JP,Moorthy BS,Blum JS,Joubert MK,Narhi LO,等人.Immunogenicity ofTherapeutic Protein Aggregates.Journal of Pharmaceutical Sciences 2016；105:417-30)。任何治療性蛋白的LMW物質都可能源于生產過程中的宿主細胞蛋白酶活性。LMW物質經常具有與抗體的單體形式相比低的活性或實質上降低的活性，同時會暴露新表位，所述新表位可以導致免疫原性或可能影響體內藥代動力學特性(Vlasak J,IonescuR.Fragmentation of monoclonal antibodies.mAbs 2011；3:253-63)。結果，HMW和LMW物質都被認為是關鍵的質量屬性，所述屬性在藥物開發過程中被常規地監測并且在制造過程中作為經純化的藥用物質的釋放試驗的一部分。

傳統上，通過多種正交分析方法來表征mAb產品的分子量異質性(Michels DA,Parker M,Salas-Solano O.Electrophoresis 2012；33:815-26)。評估mAb產品純度的最常用技術之一是在非還原條件下進行的SDS-PAGE。在分析過程中，可以常規地觀察和定量對應于LMW物質的次要帶，關于抗體，包括H2L(2條重鏈和1條輕鏈)、H2(2條重鏈)、HL(1條重鏈和1條輕鏈)、HC(1條重鏈)和LC(1條輕鏈)物質(Liu H,Gaza-Bulseco G,Chumsae C,Newby-Kew A.Biotechnology Letters 2007；29:1611-22)。

也可以觀察蛋白水解片段。通過Edman降解的N-端測序、凝膠內胰蛋白酶消化、隨后的質譜分析以及使用抗-Fc和抗-輕鏈抗體的蛋白質印跡分析，可以支持每個次要帶的提議身份。但是，從這些方法得到的任何提議結構都不能在完整蛋白水平上得到明確證實。此外，在SDS-PAGE實驗中采用的樣品制備條件會通過二硫鍵混亂而產生LMW假象，這可以導致對小量LMW物質的高估(Zhu ZC,等人.Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,83:89-95(2013))。