[發明專利]從RNA和DNA制備核酸文庫

在審

• 申請號: 201980003307.8
• 申請日: 2019-03-20
• 公開（公告）號: CN111051524A
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 徐紅霞;曹丹;A·阿拉瓦尼斯
• 申請（專利權）人: 伊魯米納公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;劉盈盈

本文提供的方法和組合物的一些實施方式涉及衍生自RNA和DNA的核酸文庫的制備和用途。在一些實施方式中，核酸文庫可以通過標簽化衍生自RNA的多核苷酸來制備。一些實施方式包括對來自這樣的文庫的序列數據的分析。

相關申請的交叉引用

本申請要求2018年3月22日提交的題為“PREPARATION OF NUCLEIC ACIDLIBRARIES FROM RNA AND DNA”的美國臨時申請號62/646487的優先權，其全部內容通過引用并入本文。

技術領域

本文提供的方法和組合物的一些實施方式涉及衍生自RNA和DNA的核酸文庫的制備和用途。在一些實施方式中，可以通過標簽化衍生自RNA的多核苷酸來制備核酸文庫。

發明背景

組織樣品的全基因組測序、基因分型、靶向再測序和基因表達分析可以具有極大的重要性，用于識別疾病生物標志物，準確診斷和預測疾病，和選擇對于患者適當的治療。例如，從患者切除的腫瘤組織的核酸序列分析可用于確定特定基因生物標志物的存在或不存在，例如體細胞變異、結構重排、點突變、缺失、插入，和/或特定基因的存在或不存在。無細胞(cell free)樣品可用于制備核酸文庫用于序列分析。然而，在這樣的文庫中包含疾病生物標志物的核酸可以是稀有且難以檢測的。因此，在疾病生物標志物的檢測中的增加的靈敏度是期望的。

發明內容

一些實施方式包括一種用于制備核酸文庫的方法，其包括：(a)使多個多核苷酸與包含標簽的多個引物雜交，其中所述多個多核苷酸包含RNA和DNA；(b)用逆轉錄酶延伸所雜交的引物；和(c)從所延伸的引物和所述DNA產生核酸文庫。一些實施方式還包括(d)測序所述核酸文庫。一些實施方式還包括(e)識別包含所述標簽的多核苷酸序列，從而識別衍生自所述多個多核苷酸的RNA多核苷酸的序列。一些實施方式還包括識別缺少所述標簽的多核苷酸序列，從而識別衍生自所述多個多核苷酸的DNA多核苷酸的序列。

在一些實施方式中，多個引物包含不同的序列。在一些實施方式中，每個引物包含不同的序列。在一些實施方式中，多個引物包含大于10,000種不同的序列。在一些實施方式中，多個引物包含大于100,000種不同的序列。在一些實施方式中，多個引物包含隨機六聚體序列。在一些實施方式中，多個引物包含相同的標簽。

在一些實施方式中，逆轉錄酶缺乏DNA依賴性聚合酶活性。在一些實施方式中，逆轉錄酶選自：禽成髓細胞瘤病毒(AMV)(avian myeloblastosis virus)逆轉錄酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)(moloney murine leukemia virus)逆轉錄酶、人免疫病毒(HIV)(humanimmunovirus)逆轉錄酶、馬傳染性貧血病毒(EIAV)(equine infectious anemia virus)逆轉錄酶、勞斯相關病毒-2(RAV2)(Rous-associated virus-2)逆轉錄酶、C.hydrogenoformans DNA聚合酶、T.thermus DNA聚合酶、T.flavus DNA聚合酶，及其功能性變體。

在一些實施方式中，(b)是在DNA多核苷酸的存在下進行。在一些實施方式中，(b)包括從延伸的引物產生雙鏈cDNA。在一些實施方式中，(c)包括使延伸的引物和DNA多核苷酸與選自激酶、連接酶、轉座子、聚合酶和測序接頭的試劑接觸。

在一些實施方式中，多個多核苷酸是無細胞的。在一些實施方式中，多個多核苷酸獲自選自血清、間質液、淋巴液、腦脊液、痰、尿液、乳液、汗液和眼淚的樣品。

一些實施方式包括用于制備核酸文庫的方法，其包括：(a)使多個多核苷酸與多個引物雜交，其中所述多個多核苷酸包含RNA和DNA；(b)用逆轉錄酶延伸所雜交的引物；和(c)從所延伸的引物和所述DNA產生核酸文庫。