[發明專利]一種用于檢測幽門螺桿菌的巢式熒光PCR方法

有效

• 申請號: 201911424740.7
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110951839B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 楊希寅;王春香
• 申請（專利權）人: 泰州健為醫學檢驗實驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京惠智天成知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11681
• 代理人: 王園園

本發明提供一種非疾病診斷目的的用于檢測幽門螺桿菌的巢式熒光PCR方法，涉及生物檢測技術領域，包括巢式熒光PCR反應的外引物、巢式熒光PCR反應的內引物、熒光PCR反應的探針序列和Block序列，所述外引物序列為SEQ ID NO1：5’?CGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAG?3’，SEQ ID NO2：5’?GCTAACAGAAACATCAAGGGTGGTATCTCAAGGATGGC?3，所述內引物序列為SEQ ID NO3:5’?ATGGGAGCTGTCTCAACCAGAG?3’，SEQ ID NO4:5’?CTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTACT?3’，所述探針的序列為SEQ ID NO5：5’?FAM?AGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGC?BHQ1?3’，所述Block序列為SEQ ID NO6：5’?CTCGTTACGCCATTCATGC?P?3’，SEQ ID NO7：5’?GCCATCCTTGAGATACCACC?P?3’。本發明操作簡單，準確性高。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種用于非疾病診斷目的的檢測幽門螺桿菌的巢式熒光PCR方法。

背景技術

幽門螺桿菌(Helicobacter pylroi，簡稱H.pylori或HP)，是一種螺旋形、微厭氧的細菌。可寄生在人的胃部，并可隨糞便少量的排出體外，全世界有超過半數的人感染HP。實驗人員通常希望從糞便中檢測幽門螺桿菌，但糞便中幽門螺桿菌含量低，而其他的雜菌含量高并且種類也極其豐富，因此在做PCR檢測的時候很容易將其他菌誤檢為幽門螺桿菌，從而出現假陽性結果。

巢式PCR技術可以增加反應的特異性和靈敏度。傳統的巢式PCR反應是先用外引物擴增目的片段，擴增完成后將PCR管打開，取出少許PCR擴增產物加入裝有內引物的PCR體系中再次進行擴增。此方法的問題在于第一次PCR后開蓋會引起氣溶膠，對后續實驗的污染，從而導致以后檢測結果出現假陽性。

因此急需提供一種操作簡單，準確性高的檢測幽門螺桿菌的巢式熒光PCR方法。

發明內容

本發明的目的是針對現有檢測幽門螺桿菌的巢式熒光PCR方法的不足，提供一種非疾病診斷目的的用于檢測幽門螺桿菌的巢式熒光PCR方法。

本發明提供了如下的技術方案：

一種非疾病診斷目的的用于檢測幽門螺桿菌的巢式熒光PCR方法，包括巢式熒光PCR反應的外引物、巢式熒光PCR反應的內引物、熒光PCR反應的探針序列和Block序列，所述外引物序列為SEQ ID NO1：5’-CGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAG-3’，SEQ ID NO2：5’-GCTAACAGAAACATCAAGGGTGGTATCTCAAGGATGGC-3，所述內引物序列為SEQ ID NO3:5’-ATGGGAGCTGTCTCAACCAGAG-3’，SEQ ID NO4:5’-CTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTACT-3’，所述探針的序列為SEQ ID NO5：5’-FAM-AGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGC-BHQ1-3’，所述Block序列為SEQ ID NO6：5’-CTCGTTACGCCATTCATGC-P-3’，SEQ ID NO7：5’-GCCATCCTTGAGATACCACC-P-3’。

所述外引物的退火溫度范圍為68℃-70℃，所述外引物在PCR反應體系中的濃度為20nM-80nM，所述內引物的退火溫度范圍為55℃-60℃，所述內引物在PCR反應體系中的濃度為100nM-400nM，所述內引物濃度為外引物濃度的5-10倍。

優選的，所述探針的退火溫度在65℃-68℃，探針在PCR反應體系中的濃度為100nM-400nM。