[發(fā)明專利]一種人類口腔微生物組群結(jié)構(gòu)及組成的研究方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911423139.6
• 申請(qǐng)日: 2019-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111187808A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 舒毅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京艾皮專利代理有限公司 11777
• 代理人: 楊克

本發(fā)明公開(kāi)了一種人類口腔微生物組群結(jié)構(gòu)及組成的研究方法，包括以下步驟：步驟1、收集唾液樣本；步驟2、唾液細(xì)菌集合DNA提取；步驟3、PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片段；步驟4、DGGE電泳；步驟5、差異條帶回切測(cè)序；步驟6、DGGE圖譜及數(shù)據(jù)分析。該方法采用DGGE技術(shù)針對(duì)樣本人群唾液樣本進(jìn)行唾液微生物組群的多樣性，了解人群口腔唾液微生物組群結(jié)構(gòu)及組成。本發(fā)明得到以下結(jié)論：DGGE能夠較為全面的反映口腔微生物群落結(jié)構(gòu)，其操作簡(jiǎn)便，是一項(xiàng)評(píng)估口腔建狀況、預(yù)估口腔疾病發(fā)生的經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的技術(shù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人類口腔微生物組群結(jié)構(gòu)及組成的研究方法，具體地說(shuō)，涉及一種人類口腔不同生長(zhǎng)發(fā)育階段微生物組群結(jié)構(gòu)及組成和個(gè)體口腔健康狀況評(píng)估的研究方法，可用以疾病篩查或者口腔亞健康狀況的評(píng)估和疾病預(yù)測(cè)。

背景技術(shù)

人體體表及體內(nèi)棲息著大量的微生物，以微生態(tài)群落的形式參與人體健康的維持與疾病發(fā)生過(guò)程，發(fā)揮著重要的作用，因此被稱為“人類第二基因”。口腔內(nèi)定植著的微生物組成特定復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境參與宿主口腔健康與疾病的調(diào)控過(guò)程。穩(wěn)定平衡的口腔微生態(tài)系在維護(hù)口腔健康中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，平衡失調(diào)是多種口腔感染性疾病發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因子，口腔致病菌過(guò)度生長(zhǎng)或益生菌生長(zhǎng)被抑制，均可導(dǎo)致口腔感染性疾病的發(fā)生，甚至引發(fā)全身系統(tǒng)性疾病。

微生態(tài)環(huán)境從“健康”狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椤凹膊　睜顟B(tài)并不是單一或者某幾種細(xì)菌的單獨(dú)作用，而是涉及到一個(gè)共生菌群，甚至是由于某些不能依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)分離培養(yǎng)的潛在致病菌的作用。變性梯度凝膠電泳技術(shù)(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是一廣泛應(yīng)用于口腔微生物組群多樣性分析的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠針對(duì)微生物16SrRNA/16S rDNA片段同時(shí)分析同菌斑生物膜中的多個(gè)菌種以方便快速了解菌斑生物膜的組成及結(jié)構(gòu)，也能夠?qū)】禈颖炯盎疾颖镜慕Y(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行快速比較，對(duì)某種致病條件下的口腔微生物生態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)控。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種人類口腔微生物組群結(jié)構(gòu)及組成的研究方法。從微生態(tài)角度出發(fā)采用不同研究方式探究牙列缺失的生理因素對(duì)口腔微生態(tài)結(jié)構(gòu)多樣性的影響，尋找老年人群口腔優(yōu)勢(shì)菌群及核心微生物，為老年口腔疾病、全身性疾病的發(fā)病病因及臨床預(yù)防、診療的新方法研究提供一定理論依據(jù)。

其技術(shù)方案如下：

一種人類口腔微生物組群結(jié)構(gòu)及組成的研究方法，包括以下步驟：

步驟1、收集唾液樣本：收集目標(biāo)群體刷牙后12小時(shí)、餐后飲后2小時(shí)非刺激性唾液樣本3ml，冷藏運(yùn)輸2小時(shí)內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃條件下冷凍保存用以提取集合DNA。

步驟2、唾液細(xì)菌集合DNA提取：采用MasterPure^TM DNA Purification Kit(Epicentre Biotechnologies)提取唾液細(xì)菌基因組DNA。

步驟3、PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片段：用DreamTaq^TM PCR Master Mix試劑盒對(duì)從唾液細(xì)菌集合DNA的16SrDNA V3區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)為不同種類細(xì)菌的通用引物：上游引物5’端特異性加了GC夾的BAC1其核苷酸序列如SEQ：ID：1所示，下游引物BAC2其核苷酸序列如SEQ：ID：2所示，擴(kuò)增后細(xì)菌V3高變區(qū)片段大小約為340bp。PCR反應(yīng)體系(50μl)：DNA模板100ng，上游引物(25μM)1μl，下游引物(25μM)1μl，預(yù)混PCR反應(yīng)液25μl，用水將整個(gè)反應(yīng)體系補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：

第一步：94℃預(yù)變性4分鐘；

第二步：94℃變性1分鐘；

第三步：56℃退火1分鐘；

第四步：72℃延伸2分鐘；

第二步至第四步循環(huán)25次；