[發(fā)明專利]一種人類口腔微生物組群結(jié)構(gòu)及組成的研究方法

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• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111187808A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 舒毅
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京艾皮專利代理有限公司 11777
• 代理人: 楊克

1.一種人類口腔微生物組群結(jié)構(gòu)及組成的研究方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1、收集唾液樣本：收集目標(biāo)群體刷牙后12小時、餐后飲后2小時非刺激性唾液樣本3ml，冷藏運(yùn)輸2小時內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃條件下冷凍保存用以提取集合DNA；

步驟2、唾液細(xì)菌集合DNA提取：采用MasterPure^TM DNA Purification Kit提取唾液細(xì)菌基因組DNA；

步驟3、PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片段：用DreamTaq^TM PCR Master Mix試劑盒對從唾液細(xì)菌集合DNA的16SrDNA V3區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，引物設(shè)計為不同種類細(xì)菌的通用引物：上游引物5’端特異性加了GC夾的BAC1其核苷酸序列如SEQ：ID：1所示，下游引物BAC2其核苷酸序列如SEQ：ID：2所示，擴(kuò)增后細(xì)菌V3高變區(qū)片段大小為340bp；PCR反應(yīng)體系：DNA模板100ng，上游引物1μl，下游引物1μl，預(yù)混PCR反應(yīng)液25μl，用水將整個反應(yīng)體系補(bǔ)齊；PCR反應(yīng)參數(shù)如下：

第一步：94℃預(yù)變性4分鐘；

第二步：94℃變性1分鐘；

第三步：56℃退火1分鐘；

第四步：72℃延伸2分鐘；

第二步至第四步循環(huán)25次；

第五步：72℃延伸5分鐘；

反應(yīng)完成后，PCR產(chǎn)物使用加有g(shù)old view的1％普通瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，100伏電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)檢測產(chǎn)品及其濃度；采用QIAGENQIAquick PCR PurificationKit對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化備用；

步驟4、DGGE電泳：點(diǎn)用通過Bio-Rad DCode基因突變檢測系統(tǒng)進(jìn)行；60％和40％的DGGE變性溶液各16ml，分別加入10％APS 18μl作為誘發(fā)劑、TEMED 150μl作為催化劑，混勻，固定于膠灌輸裝置，盡量勻速灌膠，小心插入梳子，讓凝膠聚合一個小時；并把電泳控制裝置打開，預(yù)熱電泳緩沖液到58℃；膠徹底凝固后，將PCR產(chǎn)品20μl與2X上樣液均勻混合，點(diǎn)入加樣孔；恒定電壓為60V，溫度60℃電泳過夜；16h后，分離玻璃板，將膠置于0.5％μg/ml的溴化已錠染色液EB中染色10min，1×TAE緩沖液漂洗10min，漂去多余溴化已錠，將膠取出，于膠成像系統(tǒng)中成像；為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，每組樣品重復(fù)跑膠2-3次；

步驟5、差異條帶回切測序：在紫外燈下將DGGE膠上不同的條帶切下，置于無菌EP管中，加入20μl蒸餾水浸泡，搗碎，使條帶中DNA充分溶解，于4℃過夜后取5μl浸出液體進(jìn)行測序PCR反應(yīng)，體系及反應(yīng)條件同前：DNA模板100ng，上游引物1μl，下游引物1μl，預(yù)混PCR反應(yīng)液25μl，用水將整個反應(yīng)體系補(bǔ)齊；PCR反應(yīng)物采用QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit純化后由北京中科希林科技有限公司公司對產(chǎn)物進(jìn)行測序；測序結(jié)果在Human OralMicrobiome Database數(shù)據(jù)庫的Identify 16S rRNA Blast Sequence進(jìn)行序列比對分析，找出其最相似的微生物種屬；

步驟6、DGGE圖譜及數(shù)據(jù)分析：采用Quantity One 1-D分析軟件4.6.2對采集的DGGE電泳圖像進(jìn)行分析；實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性評價采用Sorenson’s相似系數(shù)、采用樣品平均條帶數(shù)NO.和Shannon指數(shù)H’反應(yīng)樣品種群豐富性和均衡性。