[發明專利]用于鑒定霍山石斛的SSR分子標記引物及其應用

有效

• 申請號: 201911422010.3
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110878376B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 王暉;時玲玲;李暮淋;張夢函;陸穎;周玨
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 任晨晨

本發明提供了用于鑒定霍山石斛的SSR分子標記引物及其應用，與現有技術相比，本發明提供的10個多態性引物組合可將霍山石斛與鐵皮石斛，銅皮石斛等區分開來，操作簡單、重現性好、準確度高，可有效克服用表型鑒定難以準確區分的缺點。本發明還能用于石斛遺傳多樣性的研究、石斛遺傳圖譜的構建、石斛種群的親緣關系及演化和石斛遺傳育種中的應用等。

技術領域

本發明涉及分子標記技術領域，具體涉及用于鑒定霍山石斛的SSR分子標記引物及其應用。

背景技術

霍山石斛(Dendrobium huoshanense CZ.Tang et S.J.Chen)又稱米斛，是蘭科石斛屬多年生草本植物，主要分布于我國霍山大別山及鄰近地區，具有極高的觀賞和藥用價值，自古以來被認為是藥用石斛中的珍品，享有“中華仙草之最”的美譽，現代藥理研究表明：霍山石斛具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等功效，在治療白內障和降糖保肝方面有很好的作用。但由于其對生活環境的要求極為苛刻，且自身生長緩慢，加之遭到過度采挖，霍山石斛野生資源瀕臨滅絕。

關于霍山石斛的研究較多，如專利相關的有霍山石斛棚內栽培方法，霍山石斛組培苗培育及煉苗方法，一種霍山石斛楓斗加工方法，一種提高霍山石斛生物堿含量基質的制作方法等，大多停留在霍山石斛的栽培與加工方面。

但是，目前，霍山石斛產業存在種源混亂、質量混亂、名稱使用混亂的情況，很多人認為只要是從霍山出來的石斛就是霍山石斛，這種狀況是對霍山石斛的一種誤解。霍山石斛的種源是霍山石斛產業發展的源頭，如果種源質量無法保證，那么霍山石斛產業發展將被大大遏制，因此霍山石斛種質資源的鑒別尤為重要。

傳統的霍山石斛鑒定主要根據花型、花色、葉型、葉色，莖等形態特征或農藝性狀進行鑒定，主要測試品種的特異性、一致性和穩定性，這種表型鑒定方法一般只適用于那些表型差異較大的品種，而且極易受到環境影響，且霍山石斛加工成楓斗后與其他石斛類楓斗更難區分，通過形態特征鑒別常常因為主觀原因產生誤判，鑒定效率較低。

DNA分子標記技術具有遺傳穩定、不受環境影響和檢測迅速準確等優點，可以快速準確地鑒定一些外形很難區分的植物種群。近年來微衛星分子標記被廣泛應用,是一種比較理想的分子標記技術。微衛星DNA(microsatelite DNA)又稱為簡單序列重復(simplesequence repeats,SSRs)或者短串聯重復序列(short tandem repeats,STR)，是指以少數幾個核苷酸(1-6個)為重復單位的簡單串聯重復序列,通常為2-3個核苷酸。微衛星由核心序列和側翼序列組成,其核心序列呈串聯重復排列,由于重復單元的數目不同,微衛星呈現出多態性,這也就是SSR成為分子標記的根本。側翼序列DNA位于核心序列的兩側,為相對保守的特異的單拷貝序列，能使微衛星特異地定位于染色體常染色質區的特定部位,均勻地分布在整個真核生物基因組中。其特點有：(1)微衛星呈共顯性遺傳,符合孟德爾遺傳規律,可以鑒別個體是雜合子還是純合子,在植物個體鑒定方面具有特殊意義；(2)直接以DNA的形式表現,不受組織特異性、發育階段、季節、環境等影響；(3)PCR技術進行檢測，需要樣品少,僅需微量組織,并且對質量要求也不高，即便部分DNA降解,也能有效地分析鑒定；(4)標記的帶型簡單,條帶一致,客觀明確；(5)SSR標記數量豐富,分布廣,覆蓋整個基因組,揭示的多態性高；(6)具有多個等位基因,信息量大,能夠區分親緣關系較近的個體；(7)實驗重復性好,結果可靠性高。

因此，利用分子標記鑒別霍山石斛及其混偽種是十分必要的，與其他的分子標記相比，SSR分子標記檢測具有靈敏度高、數量豐富、多態性高、共顯性、重復性好和操作簡單等特點，是用來鑒定霍山石斛種質資源的理想標記。

現有技術關于霍山石斛的分子標記技術的研究，采用的方法較為傳統，使用磁珠富集法篩選多態性引物，篩選的引物多態性不高，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果并不能準確的將霍山石斛與其混偽種進行區分。

發明內容