[發明專利]用于鑒定霍山石斛的SSR分子標記引物及其應用

有效

• 申請號: 201911422010.3
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110878376B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 王暉;時玲玲;李暮淋;張夢函;陸穎;周玨
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 任晨晨

1.用于鑒定霍山石斛的SSR分子標記引物，其特征在于，所述用于鑒定霍山石斛的SSR分子標記引物包括10個引物組合，為：

HS10 F：5’-GAACTTCTAATCTTCACCGTCCA-3’；HS10 R：5’-TATAAGGATCCAATGCCTTCTCG-3’；

HS12 F:5’-AACTTCACTTAACGTCCAGCAAC-3’；HS12 R:5’-CAATATATTCGAGTGCTCTAGCCA-3’；

HS20 F:5’-CACGTAACCAGCTCTTCTGAGTT-3’；HS20 R:5’-GAATTCACCGGAGGATTAACAAT-3’；

HS23 F:5’-TTAAGAGAAGCAGAAGCAGAAGC-3’；HS23 R:5’-GTCTCACCCCTCGATTTCATAAT-3’；

HS48 F:5’-GACATTGTTGCAATCAGAACTCA-3’；HS48 R:5’-AACATCTATCAGGTTTGGAACGA-3’；

HS51 F:5’-AAGCTGAATATGAACTCTGCCAC-3’；HS51 R:5’-AGTTTTGCGTACTGAACACATCA-3’；

HS102 F:5’-GAGTTGATCCATCAGAATCATCC-3’；HS102 R:5’-TGAGCAATTACAGCATCAACATC-3’；

HS115 F:5’-AACAGATGCATCCTGATCACTAAC-3’；HS115 R:5’-CCCGTTCACTGACGAAGAAT-3’；

HS21 F:5’-TCCACTACAGACCGAGGAAGATA-3’；HS21 R:5’-TTAAGTACAACTCCACCGCAAGT-3’；

HS59 F:5’-AGAACAGCTATCACAGCGAGAAC-3’；HS59 R:5’-TGTCTCTTCAACAGCAGCTTTAC-3’。

2.一種權利要求1所述的用于鑒定霍山石斛的SSR分子標記引物的應用，其特征在于，用于石斛種植資源的鑒定、石斛遺傳多樣性的研究、石斛遺傳圖譜的構建、石斛種群的親緣關系及演化或石斛遺傳育種。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，用于石斛種植資源的鑒定的方法為：

1)提取待鑒定石斛的基因組DNA；

2)以提取的DNA為模板，利用所述用于鑒定霍山石斛的SSR分子標記引物進行PCR擴增；

3)PCR擴增產物進行測序，構建NJ系統進化樹和/或UPGMA系統樹和/或聚類圖，用于鑒定。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟1)中所述提取待鑒定石斛的基因組DNA的方法為：

稱取干燥的待鑒定石斛葉片0.020g,放入標記好的EP管內，加入已經滅菌好的鋼珠一顆，使用核酸提取儀震蕩研磨60s,取出鋼珠；加入1.4ml CTABfree液，恒溫搖床搖勻30min,離心機10000rpm離心15min,去除上清液；再向EP管中加入經65℃預熱的2％CTAB液700μl，混合均勻，65℃水浴1h,每10min手動搖勻一次；水浴結束待溶液冷卻至室溫，進行離心，10000rpm條件下離心15min,小心吸取上清液700μl,轉移到另一1.5ml離心管中，并加入70μl的提前預熱的10％CTAB，搖勻；再加入氯仿/異戊醇溶液混勻，將離心管放入搖床中搖勻10min,取出后進行12000rpm離心洗脫15min，取上清液至另一離心管，使用氯仿/異戊醇溶液按照同樣的方法重復洗脫兩次；向獲得的上清液中加入200μlNaCl溶液以及400μl-20℃預冷的異戊醇，混勻，放置于-20℃冰箱內冷凍2h；取出，12000rpm條件下進行離心15min，棄上清，向離心管中加入1000μl75％無水乙醇清洗沉淀物兩次，再用1000μl無水乙醇清洗一次，自然風干；加入100μl的TE緩沖液，室溫靜置2h,將獲得的DNA原液在1.0％瓊脂糖凝膠電泳中檢測是否具有明亮、清晰的條帶，再用分光光度計檢測DNA濃度，并稀釋至20-30ng/μl,放置于-20℃冰箱內備用。

5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟2)中PCR擴增具體為：采用15μL反應體系：7.5μl 2×TSINGKE Master Mix,1.5μl 10μmol/L的上下游引物，2μlDNA模板，ddH₂O補足至15μl；PCR擴增程序：94℃預變性4min；94℃變性45s，57℃退火35s，72℃延伸30s，共35個循環；72℃延伸8min。