[發(fā)明專利]一種改造鈷內(nèi)穩(wěn)態(tài)減少腈水合酶生產(chǎn)中鈷用量的方法

有效

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• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111019964B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發(fā)明（設計）人: 周哲敏;崔文璟;韓來闖;周麗;劉中美;郭軍玲;程中一
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了一種改造鈷內(nèi)穩(wěn)態(tài)減少腈水合酶生產(chǎn)中鈷用量的方法，屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領域。本發(fā)明所述方法中使用的Co²⁺內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)是通過引入外排蛋白RcnA和攝取蛋白NiCoT構(gòu)建而成的。在人工Co²⁺內(nèi)穩(wěn)態(tài)的幫助下，大腸桿菌對于高濃度的Co²⁺耐受性增強，同時使用型誘導系統(tǒng)表達外源基因時，蛋白可被更低濃度的Co²⁺有效誘導。將該系統(tǒng)應用于腈水合酶生產(chǎn)時，達到最大酶活的Co²⁺使用量從500μM降低至300μM，在腈水合酶的酶活和產(chǎn)量不變的基礎上，可以顯著降低Co²⁺的使用量，降低了生產(chǎn)成本，減少了生產(chǎn)過程中對環(huán)境的潛在污染。

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種改造鈷內(nèi)穩(wěn)態(tài)減少腈水合酶生產(chǎn)中鈷用量的方法，屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領域。

背景技術(shù)

腈水合酶是一種金屬酶，能夠催化腈類物質(zhì)生成酰胺類物質(zhì)，在工業(yè)生產(chǎn)上主要用于丙烯酰胺和煙酰胺的生產(chǎn)。腈水合酶可由其活性中心所含金屬離子的不同分為鈷型腈水合酶和鐵型腈水合酶。目前腈水合酶已經(jīng)在大腸桿菌中成功高效表達并擴大于工業(yè)應用。大腸桿菌生長速度快、易于培養(yǎng)、發(fā)酵工藝簡單、蛋白表達量高，這些特點使得利用大腸桿菌生產(chǎn)腈水合酶可以顯著提高其產(chǎn)量，并降低生產(chǎn)成本。在使用大腸桿菌生產(chǎn)鈷型腈水合酶時，常用IPTG作為誘導劑，并添加Co²⁺作為腈水合酶活性配體。之前已經(jīng)開發(fā)出使用Co²⁺作為誘導劑的基因表達系統(tǒng)，并將其應用于腈水合酶生產(chǎn)中。在該系統(tǒng)中，Co²⁺既作為基因表達的誘導劑，又作為金屬配體，從而不需要額外添加誘導劑，降低生產(chǎn)成本的同時也簡化了生產(chǎn)工藝。但是，鈷是一種較為昂貴的金屬，也是重要的化工產(chǎn)品如耐熱合金、硬質(zhì)合金、防腐合金、磁性合金和各種鈷鹽的重要原料。另外，鈷也具有一定毒性，泄露到自然界的鈷可造成環(huán)境污染，具有潛在的生物危害。

大腸桿菌通過Co²⁺的內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Co²⁺含量。該系統(tǒng)主要由兩部分組成，Co²⁺的攝取系統(tǒng)和外排系統(tǒng)。大腸桿菌沒有特異性攝取Co²⁺的轉(zhuǎn)運蛋白，而是通過金屬離子通用的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對包含Co²⁺在內(nèi)的多種金屬離子進行攝取。然而，大腸桿菌含有負責Co²⁺和鎳離子外排的轉(zhuǎn)運蛋白RcnA，可以主動排除細胞內(nèi)多余的Co²⁺。人工改造金屬內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，可以改變細胞內(nèi)的金屬離子濃度，從而實現(xiàn)一些特定功能。例如，已經(jīng)有人通過在大腸桿菌中引入鈷鎳攝取蛋白增加大腸桿菌對環(huán)境中Co²⁺和鎳離子的攝取，從而將其開發(fā)為凈化器以吸附污染水中的Co²⁺和Ni²⁺。然而，不過該研究的目的是增強大腸桿菌對污水中Co²⁺和Ni²⁺的富集，只提高了大腸桿菌對Co²⁺和Ni²⁺的攝取能力，并沒有考慮大腸桿菌對Co²⁺和Ni²⁺的排出能力。大腸桿菌高效表達腈水合酶的過程中，腈水合酶需要結(jié)合被大腸桿菌攝取到胞內(nèi)的Co²⁺，才能形成具有活性的酶。而細胞內(nèi)Co²⁺濃度直接決定了腈水合酶結(jié)合Co²⁺的能力，從而影響活性腈水合酶最終的產(chǎn)量。因此，提供一種改造大腸桿菌鈷內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的方法，有助于腈水合酶對Co²⁺的結(jié)合，降低生產(chǎn)過程中Co²⁺的使用量，降低生產(chǎn)成本，減少Co²⁺對環(huán)境的潛在危害。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供一種重組質(zhì)粒，是將編碼Co²⁺攝取蛋白NiCoT和Co²⁺外排蛋白RcnA的基因單獨或共同構(gòu)建至質(zhì)粒當中，并利用RBS調(diào)節(jié)NiCoT和/或RcnA的表達強度。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述NiCoT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。