[發明專利]一種改造鈷內穩態減少腈水合酶生產中鈷用量的方法

有效

• 申請號: 201911421812.2
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111019964B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 周哲敏;崔文璟;韓來闖;周麗;劉中美;郭軍玲;程中一
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

1.一種重組質粒，其特征在于，將編碼Co²⁺攝取蛋白NiCoT和Co²⁺外排蛋白RcnA的基因單獨或共同構建至質粒當中，并利用RBS調節NiCoT和/或RcnA的表達強度；所述質粒是將鈷離子響應的阻遏蛋白RcnR、受阻遏蛋白RcnR調控的啟動子與pET28a(+)載體連接得到的；所述受阻遏蛋白RcnR調控的啟動子是將阻遏蛋白RcnR的操縱序列rcnO連接到啟動子P_veg下游構建得到的；編碼所述阻遏蛋白RcnR的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述操縱序列rcnO的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述啟動子P_veg的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述NiCoT的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述RcnA的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.根據權利要求1-3任一所述的重組質粒，其特征在于，用核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的RBS_strong調節NiCoT的表達強度，用核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的RBS_weak調節RcnA的表達強度。

5.表達權利要求1-4任一所述重組質粒的大腸桿菌。

6.權利要求5所述的大腸桿菌在生產腈水合酶中的應用。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用具體是將權利要求1-4任一所述述重組質粒轉入大腸桿菌，得到重組大腸桿菌；挑取重組大腸桿菌單菌落在LB培養基中200-220rpm，35-39℃培養8-14 h；之后按1-5%接種量轉入LB培養基中200-220rpm，35-39℃培養；加入鈷離子誘導劑后，溫度降低至20-25℃進行蛋白表達。

8.權利要求5所述的大腸桿菌在環保領域中的應用。