[發明專利]一種丙二酸的全生物合成的方法

有效

• 申請號: 201911420851.0
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN113122486B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 鄧禹;趙運英;李詩韻;李國輝;毛銀;周勝虎
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/44;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種丙二酸的全生物合成的方法，屬于生物工程技術領域。本發明是以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，模塊過量表達來自大腸桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)，琥珀酸脫氫酶基因(sdhC)，琥珀酸半醛脫氫酶基因(yne1)，天門冬氨酸酶基因(aspa)，來自谷氨酸棒桿菌的異源基因天冬氨酸?α?脫氫酶基因(panD)，來自銅綠假單胞菌的異源基因β?丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因(pa0123)，構建了丙二酸的全生物合成途徑，使工程菌成功積累丙二酸。本發明丙二酸及其前體物的生物制造具有污染少、產品質量高等優點，極具發展前景。

技術領域

本發明涉及一種丙二酸的全生物合成的方法，屬于生物工程領域。

背景技術

丙二酸(malonic?acid，malonate；Propanedioic?acid；Propane?diacid)又稱胡蘿卜酸、縮蘋果酸或甜菜酸。分子結構中具有活性亞甲基和羧基兩種官能團，因而可以參加各種化學反應，是非常重要的有機合成中間體。其主要應用于香料、粘合劑、樹脂添加劑、醫藥中間體、電鍍拋光劑、爆炸控制劑、熱焊接助熔添加劑等方面。

目前工業上常用水解氰乙酸和丙二酸酯水解的方法制丙二酸。但水解氰乙酸法使用了NaCN，而氰離子有劇毒，對環境危害大，且反應過程復雜。丙二酸酯水解主要是使用丙二酸二甲(乙)酯直接進行水解來制備丙二酸，其中丙二酸酯也是通過氯乙酸進行中和，氰化等反應制備出氰乙酸，之后再酯化生產丙二酸酯，同樣對環境危害大，反應過程復雜。并且通過這兩種方法得到丙二酸需要經過復雜繁瑣的提純工序，對工業化生產有所限制。

為了解決上述問題，人們將目光聚焦到生物合成丙二酸的道路上。但由于缺乏合適的酶和代謝途徑的知識，丙二酸的生物生產研究進展緩慢。丙二酸半醛是丙二酸的重要前體，但是由于丙二酸半醛脫氫酶的缺失，使得這步轉化比較困難，也因此使得丙二酸生物生產進展緩慢。

發明內容

針對上述問題，本發明首先提供了一種產丙二酸的重組大腸桿菌，是以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，分模塊過量表達來自大腸桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)，琥珀酸脫氫酶基因(sdhC)，琥珀酸半醛脫氫酶基因(yne1)，天門冬氨酸酶基因(aspA)，來自谷氨酸棒桿菌的異源基因天冬氨酸-α-脫氫酶基因(panD)，來自銅綠假單胞菌的異源基因β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因(pa0123)。

在本發明的一種實施方式中，所述分模塊過量表達是將基因yne1、pa0123融合表達，將基因aspa、panD融合表達，將基因sdhC、ppc融合表達。

在一種實施方式中，所述ppc的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述sdhC的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述aspA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述panD的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；所述pa0123的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述yne1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。

在本發明的一種實施方式中，基因yne1、pa0123以pRSFDuet-1為表達載體；基因aspa、panD以pTrc99a為表達載體；基因片段sdhC、ppc以pCDFDuet-1為表達載體。

本發明還提供一種構建所述重組大腸桿菌的方法，包括以下步驟：

(1)以質粒pRSFDuet-1為骨架載體，連接基因片段yne1、pa0123，得到重組質粒pRSF-yne1-pa0123；

(2)以質粒pTrc99a為骨架載體，連接基因片段aspa、panD，得到重組質粒pTrc99a-aspa-panD；

(3)以質粒pCDFDuet-1為骨架載體，連接基因片段sdhC、ppc，得到重組質粒pCDF-sdhC-ppc；