[發明專利]一種丙二酸的全生物合成的方法

有效

• 申請號: 201911420851.0
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN113122486B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 鄧禹;趙運英;李詩韻;李國輝;毛銀;周勝虎
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/44;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

1.一種產丙二酸的重組大腸桿菌，其特征在于，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，分模塊過量表達來自大腸桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、琥珀酸脫氫酶基因、琥珀酸半醛脫氫酶基因、天門冬氨酸酶基因，來自谷氨酸棒桿菌的異源基因天冬氨酸-α-脫氫酶基因，來自銅綠假單胞菌的β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因；

所述分模塊過量表達是將琥珀酸半醛脫氫酶基因和β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因融合表達，將天門冬氨酸酶基因和天冬氨酸-α-脫氫酶基因融合表達，將琥珀酸脫氫酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因融合表達；

所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述琥珀酸脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述天門冬氨酸酶基因的核苷酸序列如SEQ?IDNO.3所示，所述天冬氨酸-α-脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；所述β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述琥珀酸半醛脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示；

以質粒pRSFDuet-1為骨架載體，連接基因片段琥珀酸半醛脫氫酶基因yne1、β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因pa0123；以質粒pTrc99a為骨架載體，連接基因片段天門冬氨酸酶基因aspa、天冬氨酸-α-脫氫酶基因panD；以質粒pCDFDuet-1為骨架載體，連接基因片段琥珀酸脫氫酶基因sdhC、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc。

2.一種構建權利要求1所述重組大腸桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）以質粒pRSFDuet-1為骨架載體，連接基因片段yne1、pa0123，得到重組質粒pRSF-yne1-pa0123；

（2）以質粒pTrc99a為骨架載體，連接基因片段aspa、panD，得到重組質粒pTrc99a-aspa-panD；

（3）以質粒pCDFDuet-1為骨架載體，連接基因片段sdhC、ppc，得到重組質粒pCDF-sdhC-ppc；

（4）將pRSF-yne1-pa0123、pTrc99a-aspa-panD、pCDF-sdhC-ppc共同轉入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組大腸桿菌。

3.一種生產丙二酸的方法，其特征在于，將權利要求1所述的重組大腸桿菌接種至含葡萄糖的發酵培養基中發酵生產丙二酸。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，將重組大腸桿菌于35~37℃培養至OD₆₀₀為0.6-0.8時，加入IPTG?誘導。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述誘導是在28~30℃誘導36~60?h。

6.根據權利要求3~5任一所述的方法，其特征在于，以SOB培養基為發酵培養基，

7.權利要求1所述的重組大腸桿菌或權利要求3~6任一所述方法在制備丙二酸中的應用。