[發(fā)明專利]一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911420751.8
• 申請(qǐng)日: 2019-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN111073885A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李洋;張征立;李長(zhǎng)征;王朋;康濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇耀海生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京中政聯(lián)科專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11489
• 代理人: 秦佩

本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是要建立一套分離純化相差3000bp之內(nèi)的雙鏈線性DNA分子的方法，以有利于后期的基因治療領(lǐng)域的發(fā)展。本發(fā)明根據(jù)核酸分子在中性以及pH偏大情況下帶負(fù)電荷的特性，采用陰離子交換層析，把核酸吸附在填料上，經(jīng)過洗脫，即可得到目的片段；本發(fā)明通過工藝路徑的優(yōu)化將經(jīng)酶切之后的雙鏈DNA片段進(jìn)行分離純化，且可進(jìn)行工藝放大，可在GMP條件下生產(chǎn)，有利于推進(jìn)基因治療行業(yè)的快速、規(guī)范發(fā)展。本發(fā)明針對(duì)目前少有對(duì)酶切之后的雙鏈DNA片段分離純化方法的現(xiàn)狀，尤其是對(duì)于酶切后相差3000bp之內(nèi)雙鏈DNA片段的分離純化的方案，提供了新的思路和簡(jiǎn)單有效的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法。

背景技術(shù)

質(zhì)粒(plasmid)廣泛存在于生物界，從細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人類機(jī)體中都含有。細(xì)菌質(zhì)粒是細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體(或擬核)以外的閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小可為1kb到200kb，具有自主復(fù)制能力，并能穩(wěn)定表達(dá)所攜帶的遺傳信息，是基因工程中最常用的載體。

目前已經(jīng)有技術(shù)對(duì)分子量相差較大的質(zhì)粒進(jìn)行分離的工藝較為成熟，但是很少有對(duì)酶切之后的雙鏈DNA片段進(jìn)行分離純化工藝探索與優(yōu)化，尤其是對(duì)于酶切之后兩個(gè)片段相差3000bp之內(nèi)的質(zhì)粒進(jìn)行分離純化，因而具有很好的探索及應(yīng)用空間，以有利于后期的基因治療領(lǐng)域的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是要建立一套能夠簡(jiǎn)易完成分離純化酶切之后分子量相差3000bp之內(nèi)的雙鏈線性DNA分子的方法，以有利于后期的基因治療領(lǐng)域的發(fā)展。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，該方法通過一步層析完成，所用原料及運(yùn)作參數(shù)如下：

層析系統(tǒng)：AKTA Pure150；

層析柱尺寸：21.2*150mm；

流速：3～6mL/min；

流動(dòng)相A-平衡緩沖液、流動(dòng)相B-上樣洗脫液；

平衡：至基線平穩(wěn)；

上樣：80mL酶切產(chǎn)物；

Wash：2～4個(gè)CV；

線性洗脫：28％-83％(流動(dòng)相B)洗25CV。

本發(fā)明公布的技術(shù)方案可以通過工藝路徑的方法將經(jīng)酶切之后片段進(jìn)行分離純化，并且可完成工藝放大，同時(shí)達(dá)到GMP的條件。

進(jìn)一步的，所述層析柱所用填料為GE SOURCE 30Q，該骨架采用聚苯乙烯，應(yīng)用過程中流速高，穩(wěn)定性好，其活性基團(tuán)：R-O-CH₂-CHOH-CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂-N+(CH₃)₃，可以有效結(jié)合帶負(fù)電荷的基團(tuán)，平均粒徑較小為30μm，分辨率較好。

進(jìn)一步的，所述基線平穩(wěn)具體至紫外值固定變化在0.5-1mAu。

進(jìn)一步的，所述平衡緩沖液：PH 6.5，50mM Tris-HCl，1mM EDTA；所述上樣洗脫液：PH 6.5，50mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl。

進(jìn)一步的，所述緩沖液pH值較高，并形成比核酸等電點(diǎn)pH高的環(huán)境，使得核酸帶凈負(fù)電荷，可被填料吸附。不同長(zhǎng)度的核酸帶電量不同，吸附強(qiáng)度不一，依次解離純化分離。

進(jìn)一步的，所述酶切產(chǎn)物為分子量相差3000bp之內(nèi)的雙鏈線性DNA分子。