[發(fā)明專利]一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201911420751.8
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111073885A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李洋;張征立;李長征;王朋;康濤
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇耀海生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京中政聯(lián)科專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11489
• 代理人: 秦佩

1.一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，該方法通過一步層析完成，所用原料及運(yùn)作參數(shù)如下：

層析系統(tǒng)：AKTA Pure150；

層析柱尺寸：21.2*150mm；

流速：3～6mL/min；

流動相A-平衡緩沖液、流動相B-上樣洗脫液；

平衡：至基線平穩(wěn)；

上樣：80mL酶切產(chǎn)物；

Wash：2～4個CV；

線性洗脫：28％-83％(流動相B)洗23～28CV。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述層析柱所用填料為GE SOURCE 30Q，應(yīng)用過程中流速高，穩(wěn)定性好，其活性基團(tuán)R-O-CH₂-CHOH-CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂-N+(CH₃)₃可以有效結(jié)合帶負(fù)電荷的基團(tuán)，平均粒徑較小為30μm，保障了良好的分辨率。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述基線平穩(wěn)具體至紫外值固定變化在0.5-1mAu。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述平衡緩沖液：p H 6.5，50mM Tris-HCl，1mM EDTA；所述上樣洗脫液：pH 6.5，50mM Tris-HCl，1mMEDTA，2M NaCl。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述緩沖液的pH值都較高，形成了比核酸等電點(diǎn)pH高的環(huán)境，使得核酸帶凈負(fù)電荷，可被填料吸附，不同長度的核酸，核酸帶電量不同，吸附強(qiáng)度不一，依次解離純化分離。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述酶切產(chǎn)物為分子量相差3000bp之內(nèi)的雙鏈線性DNA分子。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述酶切產(chǎn)物經(jīng)過超濾濃縮無菌化處理，并以PVDF濾膜去除內(nèi)毒素；所述層析為陰離子交換層析，吸附核酸于填料上，經(jīng)過洗脫，得到目的片段。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述層析過程后進(jìn)行誤差線性曲線的繪制，包括如下步驟：

先用nanodrop2000測定該雙鏈DNA片段濃度，然后用TEbuffer稀釋至10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL五個濃度梯度，量取峰面積做線性曲線，所用原料及試劑如下：

層析柱：TSKgel DNA-NPR色譜柱；

試劑：流動相A-平衡緩沖液(20mM Tris-HCl，pH9.0)；

流動相B-洗脫緩沖液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH9.0)；

0-100％洗脫；

流速：1mL/min；

線性洗脫：0→55％B，22CV，55％-65％B，20CV。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述洗脫過程為通過核酸吸附強(qiáng)度的差異性，致使較小長度的核酸先脫落。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于雙鏈DNA片段的純化方法，其特征在于，所述Wash：4個CV；所述線性洗脫：32％-78％(流動相B)洗26CV。