[發(fā)明專利]一種降低產(chǎn)琥珀酸放線桿菌丁二酸發(fā)酵副產(chǎn)物比例的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911420033.0
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110964754B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李億;王青艷;秦艷;朱婧;梁戈;彭龍?jiān)?/a>;潘麗霞
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西科學(xué)院
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46;C12N1/20;C12N1/38;C12R1/01
• 代理公司: 北京德崇智捷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11467
• 代理人: 高琦

本發(fā)明公開了一種降低產(chǎn)琥珀酸放線桿菌丁二酸發(fā)酵副產(chǎn)物比例的方法，包括將菌種活化擴(kuò)繁后的菌種發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為體積比5～15％，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有亞硫酸氫鹽或偏重亞硫酸鹽，添加量為1g/L～20g/L。本發(fā)明在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的過程中添加亞硫酸氫鹽或偏重亞硫酸鹽，通過與胞內(nèi)生成的中間產(chǎn)物乙酰磷酸發(fā)生加成反應(yīng)，阻礙其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸，可在不影響丁二酸產(chǎn)量的情況下，大幅降低乙酸副產(chǎn)物的含量。該工藝操作過程簡單,成本較低,具有工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說，是涉及一種降低產(chǎn)琥珀酸放線桿菌丁二酸發(fā)酵副產(chǎn)物比例的方法。

背景技術(shù)

丁二酸，又稱琥珀酸，是一種C4二元羧酸，天然存在于動(dòng)植物、人體和微生物細(xì)胞中，丁二酸，是參與細(xì)胞代謝過程——三羧酸循環(huán)(TCA)的重要中間產(chǎn)物。丁二酸可作為多種化學(xué)物質(zhì)合成的前體或中間產(chǎn)物，在食品、醫(yī)藥、化工、香料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。例如，丁二酸是合成1,4-丁二醇、γ-丁內(nèi)酯、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、己二酸等重要化合物的前體物質(zhì)。此外，丁二酸還是一種可生物降解材料—聚丁二酸丁二醇酯(PBS)合成的重要原料。

工業(yè)上生產(chǎn)丁二酸主要采用化學(xué)合成法，該法以不可再生的石化資源為原料，存在生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，不符合低碳環(huán)保、節(jié)能減排戰(zhàn)略要求。與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)原料價(jià)格低廉，為可再生生物質(zhì)資源；(2)發(fā)酵過程中可吸收大量二氧化碳，綠色環(huán)保；理論上，每生產(chǎn)1kg的丁二酸，將會(huì)有0.37kg的二氧化碳被固定，可減少溫室氣體的排放；(3)發(fā)酵條件溫和，為酶促反應(yīng)，與化學(xué)合成法相比，可節(jié)能30～40％。因此，開展微生物發(fā)酵可再生資源高效合成丁二酸的研究，有利于提升產(chǎn)業(yè)競爭力和拓展下游產(chǎn)業(yè)鏈，因而備受人們的關(guān)注。

在眾多的丁二酸天然高產(chǎn)菌株中，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(A.succinogenes)由于具有能利用多種碳源(葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、維二糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、木糖等)并能夠耐受高濃度的丁二酸鹽和葡萄糖、發(fā)酵主要產(chǎn)物為丁二酸等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具工業(yè)化潛力的丁二酸生產(chǎn)菌株之一。在自然條件下，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌以葡萄糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，主產(chǎn)物主要為丁二酸和乙酸，此外還有少量的甲酸、乳酸和乙醇；而且由于積累的丁二酸濃度不高以及副產(chǎn)物乙酸的大量存在，導(dǎo)致產(chǎn)琥珀酸放線桿菌野生菌株并不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，因此需要對菌株進(jìn)行選育、改良以及發(fā)酵工藝優(yōu)化。在國外，美國密西根生物技術(shù)研究院(MEI)Zeikus課題組在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸方面，在1996年篩選出一株高產(chǎn)丁二酸菌株130Z，并以130Z為出發(fā)菌株，篩選出高抗單氟乙酸自發(fā)突變株，并在最適條件下，使用該抗性株發(fā)酵48h，發(fā)酵產(chǎn)物中的琥珀酸/乙酸比例高達(dá)85:1，琥珀酸/甲酸比例高達(dá)160:1，丁二酸產(chǎn)量可以達(dá)到80～110g/L，得率高達(dá)97％，使丁二酸發(fā)酵獲得了突破性進(jìn)展。在國內(nèi)，姜岷課題組通過對牛瘤胃中的微生物菌群在含富馬酸二鈉的培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，然后進(jìn)行分類，得到一株高產(chǎn)丁二酸的放線桿菌NJ113，該菌株產(chǎn)丁二酸最高可達(dá)48g/L，同時(shí)副產(chǎn)物乙酸、甲酸、乳酸較多；申乃坤等也采用類似的方法從牛瘤胃中篩選到一株高產(chǎn)丁二酸的放線菌株GXAS-137，該菌株在后續(xù)發(fā)酵中能積累高達(dá)70g/L的丁二酸，但乙酸、甲酸、乳酸等副產(chǎn)物仍比較多；江南大學(xué)的孫志浩課題組，篩選出菌株Actinobacillus succinogens CGMCC1593，并對其誘變選育得到菌株SF-9，該菌株在5L發(fā)酵罐上發(fā)酵36h丁二酸產(chǎn)量達(dá)40.51g/L，但仍然存在乳酸、甲酸和乙酸等副產(chǎn)物。潘麗軍等利用低拷貝質(zhì)粒PLG338對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的乙醇脫氫酶(ADH)進(jìn)行敲除失活，使碳代謝流發(fā)生變化，ADH酶活降低了90％，最終丁二酸產(chǎn)量達(dá)到了65.7g/L。