[發明專利]一種從動物胰臟中提取三種酶的工藝方法

有效

• 申請號: 201911418803.8
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111117989B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 萬偲;徐富勇;陳潔玉;耿衛鋒;李國龍
• 申請（專利權）人: 江西浩然生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N9/76
• 代理公司: 北京睿博行遠知識產權代理有限公司 11297
• 代理人: 龔家驊

1.一種從動物胰臟中提取三種酶的工藝方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）將動物胰臟進行絞碎處理，得到組織碎漿；

（2）在所述組織碎漿中加入氯化鈣溶液，將pH調節至7.0，在35℃-45℃范圍進行保溫；

（3）所述組織碎漿保溫完畢后加入硅藻土，進行過濾處理，將得到的濾液1進行超濾濃縮處理，得到濃縮液；

（4）將所述濃縮液上樣至平衡處理后的陰離子交換層析柱，進行洗脫處理，收集過柱液1與洗脫流出液1；

（5）將所述洗脫流出液1上樣至平衡處理后的疏水層析柱，進行洗脫處理，收集洗脫流出液2，所述洗脫流出液2依次進行超濾除鹽處理，膜過濾處理，得到濾液2，將所述濾液2凍干，得到高純度胰激肽原酶；

（6）將所述過柱液1上樣至平衡處理后的陽離子交換層析柱，進行洗脫處理，收集過柱液2，和洗脫流出液3，將所述洗脫流出液3依次進行超濾除鹽處理，膜過濾處理，得到濾液3，將所述濾液3凍干，得到彈性酶；

（7）將所述過柱液2上樣至平衡處理后的親和層析柱，進行洗脫處理，收集洗脫流出液4，所述洗脫流出液4依次進行超濾除鹽處理，膜過濾處理，得到濾液4，將所述濾液4凍干，得到高純度糜蛋白酶。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟（2）中：

所述氯化鈣溶液濃度為1-5%的氯化鈣溶液，所述保溫時間為2-4小時。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟（4）中：

所述陰離子交換層析柱的層析介質為Q Sepharose FF，所述平衡處理中使用的平衡液為0.1M-0.2M HAc-NaAc溶液，所述洗脫處理中使用的洗脫液為0.1M-0.2M HAc-NaAc+0.4M-0.6M NaCl溶液。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟（5）中：

所述疏水層析柱的層析介質為Phenyl Sepharose 6 FF，所述平衡處理中使用的平衡液為0.02M PB+1.2M (NH₄)₂SO₄溶液，所述洗脫處理中使用的洗脫液為0.02 M PB+0.2 M(NH₄)₂SO₄溶液。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟（6）中：

所述陽離子交換層析柱的層析介質為SP Sepharose 6 FF，所述平衡處理中使用的平衡液為0.02M PB溶液，所述洗脫處理中使用的洗脫液為0.02M PB+0.3M NaCl溶液。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟（7）中：

所述親和層析柱的層析介質為O-Anisidin-ACA-Sepharose，所述平衡處理中使用的平衡液為0.1M NaAc，所述洗脫處理中使用的洗脫液為0.02M NaAc+1.5M KCl溶液；

所述O-Anisidin-ACA-Sepharose由以下方法制備：

將載體Sepharose4B轉入二氧六環有機相；

將羰基二咪唑溶于所述二氧六環中，同所述載體Sepharose4B混合進行反應；

將反應后的產物置換到水相中，得到活化的載體介質；

將所述活化的載體介質加入到氨基己酸溶液中，進行縮合反應，得到氨基己酸-瓊脂糖；

將所述氨基己酸-瓊脂糖與鄰氨基苯甲醚發生偶聯反應，得到所述O-Anisidin-ACA-Sepharose介質。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述超濾濃縮處理使用的是10KD超濾膜，所述超濾除鹽處理使用的是10KD超濾膜，所述膜過濾處理使用的是0.2微米除菌膜。

8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述將載體Sepharose4B轉入二氧六環有機相，具體為：

將所述載體Sepharose4B充分清洗后，再依次用濃度遞增的二氧六環溶液置換到無水二氧六環中。

9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述將反應后產物置換到水相中，具體為：

將反應后的產物依次用濃度遞減的二氧六環洗滌，最后置換到水相中。