[發(fā)明專利]一種細胞分離培養(yǎng)液和T細胞分離培養(yǎng)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911415731.1
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111088227A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設計）人: 馬玉國
• 申請（專利權）人: 廣州航華生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張東梅

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種細胞分離培養(yǎng)液和T細胞分離培養(yǎng)的方法。本發(fā)明公開了一種細胞分離培養(yǎng)液。本發(fā)明中，培養(yǎng)液A、培養(yǎng)液B和培養(yǎng)液C，三種培養(yǎng)液協(xié)同配合，共同作用，有利于刺激單核細胞向CIK細胞進行轉化。通過向血細胞中加入中性粒細胞分離液，從而減少細胞中中性粒細胞的含量。使用中性粒細胞分離液提取單個核細胞后，使用紅細胞裂解液去除單個核細胞層中大部分紅細胞，明顯減少單個核細胞中的紅細胞含量，提高淋巴細胞數量。最終培養(yǎng)后細胞中有效細胞比例增加，增加細胞群的殺瘤活性。

技術領域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種細胞分離培養(yǎng)液和T細胞分離培養(yǎng)的方法。

背景技術

T細胞，是由來源于骨髓的淋巴干細胞，在胸腺中分化、發(fā)育成熟后，通過淋巴和血液循環(huán)而分布到全身的免疫器官和組織中發(fā)揮免疫功能。

過繼性免疫細胞治療是指從人體內分離免疫活性細胞，在體外進行擴增和功能鑒定，然后向人體回輸，從而達到直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體的免疫應答殺傷腫瘤細胞的目的。過繼性T細胞治療主要包括TIL、LAK、CIK、TCR-T、CAR-T等幾大類。

目前體外培養(yǎng)T細胞通常包括以下4個步驟：分離單個核細胞、激活誘導、擴增、收集。目前分離單個核細胞通常是使用Ficoll實現(xiàn)，常規(guī)的T細胞培養(yǎng)方法是將分離的單個核細胞用因子進行刺激誘導，最終獲得一定數量的T細胞。

在使用Ficoll提取單個核細胞進行T細胞的培養(yǎng)時，由于部分血液供體機體狀態(tài)原因，分離出的單個核細胞中還夾雜著大量紅細胞。若直接進行培養(yǎng)，不僅在培養(yǎng)周期中難以觀察T細胞的生長情況，且影響T細胞的培養(yǎng)環(huán)境，并影響后續(xù)對T細胞性能的檢測和T細胞性能。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種細胞分離培養(yǎng)液和T細胞分離培養(yǎng)的方法，該細胞分離培養(yǎng)液使用紅細胞裂解液去除單個核細胞層中大部分紅細胞，明顯減少單個核細胞中的紅細胞含量，提高T細胞數量，提高檢測的準確性，最終培養(yǎng)后T細胞中有效細胞比例增加，增加細胞群的殺瘤活性。

其具體技術方案如下：

本發(fā)明提供了一種細胞分離培養(yǎng)液，包括：中性粒細胞分離液、紅細胞裂解液、培養(yǎng)液A、培養(yǎng)液B和培養(yǎng)液C；

所述培養(yǎng)液A為：IFN-γ和基礎培養(yǎng)基；

所述培養(yǎng)液B為：IL-2、IL-1α、CD3單克隆抗體和基礎培養(yǎng)基；

所述培養(yǎng)液C為：IL-2和基礎培養(yǎng)基。

本發(fā)明中，通過向血細胞中加入中性粒細胞分離液，從而減少細胞中中性粒細胞的含量。使用中性粒細胞分離液提取單個核細胞后，使用紅細胞裂解液去除單個核細胞層中大部分紅細胞，明顯減少單個核細胞中的紅細胞含量，提高淋巴細胞數量。最終培養(yǎng)后細胞中有效細胞比例增加，增加細胞群的殺瘤活性。

本發(fā)明細胞分離液中的細胞優(yōu)選為T細胞。

本發(fā)明將培養(yǎng)液B中IL-2、IL-1α和CD3單克隆抗體進行復配，結合培養(yǎng)液A和培養(yǎng)液C共同作用，有利于刺激單核細胞向CIK細胞進行轉化。本發(fā)明所述細胞優(yōu)選為CIK細胞。

本發(fā)明中，所述培養(yǎng)液A中IFN-γ的終濃度為2500～5000IU/ml，更優(yōu)選為5000IU/ml；

所述培養(yǎng)液B中的IL-2、IL-1α、CD3單克隆抗體的終濃度分別為500～1000IU/ml、2.5～5ng/ml、250～500ng/ml，更優(yōu)選分別為1000IU/ml、5ng/ml、500ng/ml；

所述培養(yǎng)液C中的IL-2終濃度為500～1000IU/ml，更優(yōu)選為1000IU/ml。

本發(fā)明中，細胞培養(yǎng)液還包括自體血漿。將自體血漿作為營養(yǎng)物質，避免了胎牛血清的使用，減少外源致熱源，致敏污染，且降低了培養(yǎng)成本。