[發(fā)明專(zhuān)利]測(cè)定血漿中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素濃度的HPLC-MS/MS方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911412887.4
• 申請(qǐng)日: 2019-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111208218A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王櫻桃;滕馨瑩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安領(lǐng)生物醫(yī)藥（蘇州）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72
• 代理公司: 蘇州隆恒知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32366
• 代理人: 周子軼

1.一種測(cè)定血漿中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素濃度的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述方法中采用柳胺酚作為內(nèi)標(biāo)，所述方法包括以下步驟：

儲(chǔ)備液的制備：用HPLC甲醇作為溶劑，配置得到苦杏仁苷儲(chǔ)備液、柚皮素儲(chǔ)備液、槲皮素儲(chǔ)備液以及柳胺酚儲(chǔ)備液；

工作液的制備：用HPLC甲醇和水作為溶劑，將所述苦杏仁苷儲(chǔ)備液、柚皮素儲(chǔ)備液、槲皮素儲(chǔ)備液分別配置，獲得苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液；用HPLC甲醇作為溶劑，將所述柳胺酚儲(chǔ)備液制備成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中的柳胺酚濃度為50ng/mL；

校正標(biāo)準(zhǔn)品的制備：取空白血漿，將所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血漿中，獲得校正標(biāo)準(zhǔn)品；

質(zhì)控樣品的制備：取空白血漿，將所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血漿中，獲得質(zhì)控樣品；

樣品的檢測(cè)分析：取96孔板，在所述96孔板上做標(biāo)示，并向各個(gè)樣品孔內(nèi)加入對(duì)應(yīng)的樣品；向?qū)?yīng)的樣品中相應(yīng)地加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇以進(jìn)行蛋白沉淀；對(duì)蛋白沉淀后的各樣品進(jìn)行離心作用，并分別提取上清液；將各上清液進(jìn)行稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)樣分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，液相色譜參數(shù)如下：

色譜柱：Inertstain AQ-C18 2.1*50mm，5μm，柱溫為40℃；

流動(dòng)相：所述流動(dòng)相的體積為500μL，包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，所述流動(dòng)相A為：乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.2％的乙酸水溶液，所述流動(dòng)相B為：乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.2％的乙酸甲醇溶液；

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子原，負(fù)離子檢測(cè)，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)工作方式進(jìn)行一/二級(jí)質(zhì)譜分析，質(zhì)譜檢測(cè)工作參數(shù)如下：苦杏仁苷的母離子/特征子離子的檢測(cè)離子對(duì)為456.2/323.1，柚皮素的母離子/特征子離子的檢測(cè)離子對(duì)為271.1/151.2，槲皮素的母離子/特征子離子的檢測(cè)離子對(duì)為301.1/151.1，柳胺酚的母離子/特征子離子的檢測(cè)離子對(duì)為228.1/210.0。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，流動(dòng)相梯度洗脫條件為：第0.01～0.1min，所述流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為85％；第0.5min，所述流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為60％；第1min，所述流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為20％；第2～3min，所述流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為0；第3.01～3.40min，所述流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為50％；第3.41～4.50min，所述流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為0；第4.51～5.80min，所述流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為85％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的濃度分別介于100ng/mL～100000ng/mL之間。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述校正標(biāo)準(zhǔn)品中，所述苦杏仁苷、柚皮素和槲皮素的濃度分別介于5.0～5000ng/mL之間。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)控樣品中，所述苦杏仁苷、柚皮素和槲皮素的濃度分別介于5.0～3750ng/mL之間。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)蛋白沉淀后的各樣品進(jìn)行離心作用的條件包括：在10℃，4000rpm條件下離心10min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述空白血漿為比格犬血漿。