[發明專利]測定血漿中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素濃度的HPLC-MS/MS方法

在審

• 申請號: 201911412887.4
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111208218A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 王櫻桃;滕馨瑩
• 申請（專利權）人: 安領生物醫藥（蘇州）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72
• 代理公司: 蘇州隆恒知識產權代理事務所(普通合伙) 32366
• 代理人: 周子軼

本發明公開了一種測定血漿中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素濃度的HPLC?MS/MS方法，包括以下步驟：儲備液的制備；將各儲備液稀釋成苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液和柳胺酚工作液；校正標準品的制備：取空白血漿，將所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血漿中，獲得校正標準品；控樣品的制備：取空白血漿，將所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血漿中，獲得質控樣品；樣品的檢測分析。本發明所述的方法，具有快捷性、靈敏度高、精密度和準確度良好、提取回收率高、無明顯基質效應和稀釋效應的優點。

技術領域

本發明涉及了臨床血藥濃度監測控制技術領域，具體的是一種測定血漿中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素濃度的HPLC-MS/MS方法。

背景技術

肝纖維化是肝病中的一種。人體患有肝纖維化后，容易出現疲乏無力、食欲減退等癥狀，可能還會出現慢性消化不良、出血等癥狀，這些癥狀會給人體造成很大傷害。

扶正化瘀片是常用的治療肝纖維化的中成藥之一，其主要成分包括：五味子醇甲(Schisandrin)、五味子乙素(γ-Schisandrin)、馬索亞內酯(Massoia Lactone)、丹參素鈉(Sodium Danshensu)、野黑櫻苷(Prunasin)、苦杏仁苷(Amygdalin)、柚皮素(Naringenin)、槲皮素(Quercetin)、蘆丁(Rutin)、商陸苷(Ombuoside)及其代謝產物商陸素(Ombuin)、槲皮苷(Quercitrin)、山奈酚(Kaempferol)、葵烯酸鈉(Sodium 5-Hydroxy-2-Decenoic)。檢測比格犬(Beagle犬)血漿中扶正化瘀片的毒代動力學特征，評估藥物主要成分在比格犬體內的暴露水平，對于幫助了解藥物在人體內的作用效果具有重要意義。因此，本領域技術人員持續致力于研究測定血漿中扶正化瘀片主要成分濃度的HPLC-MS/MS方法。

發明內容

為了克服現有技術中的缺陷，本發明實施例提供了一種測定血漿中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素濃度的HPLC-MS/MS方法，其檢測時間短、靈敏度高、定量準確。

本申請實施例公開了：一種測定血漿中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素濃度的HPLC-MS/MS方法，所述方法中采用柳胺酚作為內標，所述方法包括以下步驟：

儲備液的制備：用HPLC甲醇作為溶劑，配置得到苦杏仁苷儲備液、柚皮素儲備液、槲皮素儲備液以及柳胺酚儲備液；

工作液的制備：用HPLC甲醇和水作為溶劑，將所述苦杏仁苷儲備液、柚皮素儲備液、槲皮素儲備液分別配置，獲得苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液；用HPLC甲醇作為溶劑，將所述柳胺酚儲備液制備成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中的柳胺酚濃度為50ng/mL；

校正標準品的制備：取空白血漿，將所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血漿中，獲得校正標準品；

質控樣品的制備：取空白血漿，將所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血漿中，獲得質控樣品；

樣品的檢測分析：取96孔板，在所述96孔板上做標示，并向各個樣品孔內加入對應的樣品；向對應的樣品中相應地加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇以進行蛋白沉淀；對蛋白沉淀后的各樣品進行離心作用，并分別提取上清液；將各上清液進行稀釋，然后進樣分析。

具體的，所述方法中，液相色譜參數如下：

色譜柱：Inertstain AQ-C18 2.1*50mm，5μm，柱溫為40℃；

流動相：所述流動相的體積為500μL，包括流動相A和流動相B，所述流動相A為：乙酸體積分數為0.2％的乙酸水溶液，所述流動相B為：乙酸體積分數為0.2％的乙酸甲醇溶液；