[發(fā)明專(zhuān)利]A型FMDV 1D蛋白-鐵蛋白融合蛋白、蛋白籠納米顆粒及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911411903.8
• 申請(qǐng)日: 2019-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111171157A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭玉堃;于朋偉;郭豫杰;曾磊;楊國(guó)宇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K19/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C07K1/22;C12N1/21;A61K39/135;A61K47/64;A61P31/14;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州大通專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 張立強(qiáng)

本發(fā)明公開(kāi)了A型FMDV 1D蛋白?鐵蛋白融合蛋白、蛋白籠納米顆粒及其制備方法。本發(fā)明將含有A型FMDV優(yōu)勢(shì)表位與鐵蛋白片段的核苷酸序列串聯(lián)，設(shè)計(jì)并合成了A型FMDV 1D蛋白表位?鐵蛋白片段；然后與促溶標(biāo)簽和親和標(biāo)簽EW29相連，得到EW29/促溶標(biāo)簽/A型FMDV 1D蛋白表位?鐵蛋白片段，誘導(dǎo)、親和純化后即得A型FMDV 1D蛋白?鐵蛋白融合蛋白。電鏡結(jié)果顯示，該融合蛋白形成了20～25 nm的蛋白籠納米顆粒。本發(fā)明為進(jìn)一步研制安全、有效的A型FMDV 1D蛋白疫苗奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及A型FMDV 1D蛋白-鐵蛋白融合蛋白、蛋白籠納米顆粒及其制備方法。

背景技術(shù)

通過(guò)DNA重組技術(shù)，融合蛋白已經(jīng)很容易在原核表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌）和真核表達(dá)系統(tǒng)（酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）進(jìn)行高效表達(dá)，其產(chǎn)物在生物和醫(yī)學(xué)上得到了廣泛應(yīng)用，也促進(jìn)了其快速發(fā)展。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌由于易操作、廉價(jià)和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，仍然是目前生產(chǎn)重組蛋白的主要宿主。但是，當(dāng)大腸桿菌細(xì)菌系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白時(shí)，有許多本身難以克服的缺點(diǎn)：1、重組蛋白往往以無(wú)活性的包涵體形式出現(xiàn)；2、缺乏真核細(xì)胞翻譯后修飾（糖基化、磷酸化和乙酰化等）機(jī)制，得到的重組蛋白雖然在一級(jí)氨基酸序列正確，但在高級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象上與天然蛋白相差較大，無(wú)活性或活性極差；3、宿主細(xì)胞（大腸桿菌）自身蛋白成為熱原，難以除去，存在安全性，這些問(wèn)題限制了原核表達(dá)的重組蛋白在實(shí)際中的進(jìn)一步應(yīng)用。鑒于此，選擇更有效的親和促溶性標(biāo)簽以期獲得純度高、可溶性好，活性強(qiáng)的重組蛋白至關(guān)重要。

來(lái)自蚯蚓（Lumbricus terrestris）半乳糖結(jié)合凝集素EW29 C-末端的半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其分子量為14.5kDa，可以和親和層析的常用介質(zhì)瓊脂糖的半乳糖殘基可逆結(jié)合，是一個(gè)高效的親和標(biāo)簽。同時(shí)，EW29蛋白本身有很好的可溶性，和其它外源蛋白融合表達(dá)時(shí)，可以促進(jìn)外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性（Yabe R, Suzuki R, Kuno A, Fujimoto Z,Jigami Y and Hirabayashi J (2007) Tailoring a novel sialic acidbinding lectinfrom a ricin-B chain-like galactosebinding protein by natural evolution-mimicry. J Biochem 141, 389–399.）。

鐵蛋白(Ferritin)幾乎存在于藻類(lèi)、細(xì)菌、高等植物和動(dòng)物等所有生物體，是生物體生命所必需的。蛋白殼是由24個(gè)亞基以高度對(duì)稱(chēng)性方式組成的內(nèi)空心結(jié)構(gòu)，空心直徑約為8nm，外直徑約為12nm。研究發(fā)現(xiàn)鐵蛋白在體外可以自組裝，形成套袖樣的蛋白籠納米顆粒；同時(shí)，鐵蛋白納米籠可以將外源小分子蛋白裝入其納米籠內(nèi)，從而有效降低小分子抗原的降解，提高抗原的有效濃度，還可以有效協(xié)助靶細(xì)胞對(duì)相應(yīng)抗原的攝取、加工，顯著增強(qiáng)抗原蛋白的抗原穩(wěn)定性和免疫原性。因此，鐵蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)使其可以作為一種新型的抗原遞呈納米運(yùn)送平臺(tái)。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由 FMD 疫病毒(FMDV)引起偶蹄動(dòng)物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，F(xiàn)MDV 屬于微 RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員，病毒基因組為單股正鏈 RNA，全長(zhǎng)約為 8.5 kb，四種結(jié)構(gòu)蛋白 VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1B） 和VP1（1D）與 FMDV RNA 組裝成為成熟的病毒粒子。FMDV 根據(jù)血清型特點(diǎn)的不同，可以分為A 型、O 型、C 型、南非 I 型、南非 II 型、南非 III 型和亞洲 I 型七個(gè)血清型。研究表明，各型 FMDV 的 VP1 （1D）參與組成病毒的主要中和抗原位點(diǎn)，尤其是 VP1 的 140～160和 200～213 氨基酸殘基。