[發(fā)明專利]一種針對(duì)腫瘤疫苗免疫響應(yīng)檢測(cè)的陽(yáng)性多肽池及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911410007.X
• 申請(qǐng)日: 2019-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN111040039B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莫凡;黃勤學(xué);陳霖;林志偉;韓寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州紐安津生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 杭州裕陽(yáng)聯(lián)合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 金方瑋

本發(fā)明公開了一種針對(duì)腫瘤疫苗免疫響應(yīng)檢測(cè)的陽(yáng)性多肽池及其制備方法，陽(yáng)性多肽池由以下多肽序列制備成的多條組合肽組成；多肽序列包括：將能夠與MHC I型分子結(jié)合并被高效遞呈、引起免疫應(yīng)答的表位肽序列，標(biāo)記為A段序列；將能夠與MHC II型分子結(jié)合并被高效遞呈、引起免疫應(yīng)答的表位肽序列，標(biāo)記為B段序列；通過(guò)Linker序列連接A段序列和B段序列成為完整的多肽序列；使用本發(fā)明制備出的陽(yáng)性多肽池能夠用作多肽疫苗免疫響應(yīng)體外檢測(cè)正對(duì)照刺激物的多肽池，使得到的通用型陽(yáng)性多肽池具有與腫瘤多肽疫苗相似的刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生響應(yīng)的作用機(jī)理，避免產(chǎn)生假陰性情況，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定可靠。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種針對(duì)腫瘤疫苗免疫響應(yīng)檢測(cè)的陽(yáng)性多肽池及其制備方法。

背景技術(shù)

2019年1月，國(guó)家癌癥中心發(fā)布了最新一期統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2015年我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬(wàn)人，死亡約233.8萬(wàn)人。平均每天超過(guò)1萬(wàn)人被確診為癌癥，每分鐘有7.5個(gè)人被確診為癌癥。盡管攻克腫瘤是研究人員一直以來(lái)追求的目標(biāo)，但還存在著巨大的困難。其中一個(gè)重要原因是廣泛存在的腫瘤異質(zhì)性。不僅在腫瘤組織內(nèi)部，即使是同一類型的腫瘤在不同患者間也存在著極大的差異。快速生長(zhǎng)增殖的癌細(xì)胞往往來(lái)不及修復(fù)DNA在復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的編碼錯(cuò)誤，從而出現(xiàn)新的突變蛋白，即腫瘤新生抗原(neoantigen)。隨著科學(xué)家們研究的深入，在2017年發(fā)表于《Nature》雜志的兩項(xiàng)獨(dú)立研究結(jié)果表明，通過(guò)篩選預(yù)測(cè)腫瘤患者體內(nèi)特異性表達(dá)的腫瘤新生抗原，設(shè)計(jì)制備得到針對(duì)每個(gè)患者的個(gè)體化腫瘤新生抗原疫苗，可以有效激活黑色素瘤中晚期復(fù)發(fā)高危患者自身免疫系統(tǒng)，初步實(shí)現(xiàn)真正的個(gè)體化腫瘤精準(zhǔn)治療。目前已經(jīng)報(bào)道在研的新生抗原腫瘤疫苗的類型主要有多肽、RNA、DNA和免疫細(xì)胞(如樹突細(xì)胞和T細(xì)胞)。因此，基于腫瘤疫苗研究的重要性，需要開發(fā)能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)疫苗免疫響應(yīng)效果的技術(shù)或產(chǎn)品。

在腫瘤免疫治療中，多肽刺激的免疫細(xì)胞因子及抗體體外驗(yàn)證是檢驗(yàn)多肽免疫原性的有效方法。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISpot)是一種成熟的體外檢測(cè)多肽疫苗免疫響應(yīng)的技術(shù)[3]。人體免疫系統(tǒng)在受到刺激物的刺激后，部分刺激物能夠直接被T細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生免疫響應(yīng)，另一些則需要通過(guò)APC(抗原遞呈細(xì)胞)將刺激物抗原信息處理并呈遞給T細(xì)胞，進(jìn)而由T細(xì)胞分泌出特定細(xì)胞因子，最后通過(guò)ELISpot技術(shù)以斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來(lái)，斑點(diǎn)的強(qiáng)弱和數(shù)量反映了細(xì)胞對(duì)刺激物的反應(yīng)能力和分泌目的細(xì)胞因子的能力。ELISpot試驗(yàn)需要設(shè)置復(fù)雜的對(duì)照組，包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。目前在ELISpot實(shí)驗(yàn)中比較常用的陽(yáng)性對(duì)照刺激物有CEF peptide pool(病毒短肽池：由若干長(zhǎng)度為9-15個(gè)氨基酸的多肽組成)、PHA(植物凝集素)、PMA(佛波酯)和Ionomycin(離子霉素)。T細(xì)胞無(wú)法直接識(shí)別天然蛋白質(zhì)抗原信息，只能識(shí)別與MHC分子形成復(fù)合物的抗原肽成分，需要其它免疫細(xì)胞的輔助。抗原遞呈細(xì)胞APC能內(nèi)吞蛋白質(zhì)抗原，降解為多肽并表達(dá)于細(xì)胞表面形成MHC-抗原復(fù)合物，進(jìn)一步由T細(xì)胞識(shí)別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。以DC細(xì)胞為例，DC在未成熟階段具有很強(qiáng)的吸收并消化處理長(zhǎng)多肽的能力，但是把抗原信息遞呈給T細(xì)胞的能力很弱，然而當(dāng)DC發(fā)育成熟后，它形成MHC-抗原復(fù)合物并且遞呈給T細(xì)胞的能力會(huì)變強(qiáng)。目前的陽(yáng)性對(duì)照物，其中CEF可以直接和MHC結(jié)合形成MHC-抗原復(fù)合物，只需要抗原遞呈細(xì)胞(APC)的遞呈(不需要攝取加工)，而PHA、PMA、Ionomycin都是直接刺激T細(xì)胞，都不需要APC的參與[4]，所以這些陽(yáng)性對(duì)照物并不能完全模擬蛋白質(zhì)抗原經(jīng)過(guò)未成熟DC到成熟DC然后遞呈給T細(xì)胞的復(fù)雜過(guò)程。