[發明專利]一種農桿菌介導的菊花轉染體系的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201911409984.8
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110904147A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 周旭紅;楊曉密;葉世隆;李姝影;曹磊;毛羽;羅柯佳
• 申請（專利權）人: 云南中醫藥大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/14
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 呂紀濤

本發明提供了一種農桿菌介導的菊花轉染體系的構建方法及其應用，涉及遺傳轉化技術領域，通過研究農桿菌轉化時所涉及到的各項影響條件，包括培養基種類、激素種類及濃度、菌液濃度、侵染時間、侵染條件、共培養時間、抗生素濃度等，提供了一套適合菊花的農桿菌介導轉化體系，提高轉化率，獲得更多的陽性轉基因植株。利用本發明的構建方法，利用愈傷組織獲得再生植株，再生率為90～95％；經PCR檢測，轉基因陽性率為70～90％，可用于獲得難以通過傳統育種方式生產的菊花新品種。

技術領域

本發明屬于遺傳轉化技術領域，具體涉及一種農桿菌介導的菊花轉染體系的構建方法及其應用。

背景技術

菊花(Chrysanthemum morifolium)起源于我國，有著3000多年的悠久歷史，因其豐富的形態，艷麗的色彩和悠久的文化而深受人們的喜愛。菊花不但有觀賞性，還有較高的食用及藥用價值，多數的菊花品種還具有抗菌消炎、清熱明目的作用，在我國古代醫書中就有很多關于菊花入藥的記錄。觀賞、藥用及食用價值給菊花帶來越來越高的經濟價值，為了滿足消費者的需要，菊花的種質資源不斷豐富，不同花色、花型、花期的菊花不斷上市，菊花的銷售市場越來越活躍。但藍色花色的菊花依然是空白，培養藍色的轉基因菊花新品種是近年來菊花育種的目標。

農桿菌介導的植物基因轉化系統目前廣泛應用于植物基因工程研究，在菊花的遺傳轉化中最大的難題是轉化效率低：如在“農桿菌介導CBL基因對菊花品種‘C008’的轉化(西北林學院學報，2017，32(1):184-189)”一文中介紹以菊花品種‘C008’無菌苗葉片作為外植體進行轉化，最終轉化率為12.2％，轉化率較低；又如“菊花CmDREBa-2基因的同源轉化及功能驗證”(沈陽農業大學，碩士學位論文，2018)一文中對菊花品種‘早玉盤’進行遺傳轉化，轉化率為37.5％。如何利用農桿菌介導菊花的高效遺傳轉化體系，則成為亟待解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種農桿菌介導的菊花轉染體系的構建方法，可簡單高效的對菊花進行遺傳轉化，同時能夠突破菊花自身遺傳屏障，獲得難以通過傳統育種方式生產的新品種。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種農桿菌介導的菊花轉染體系的構建方法，包括以下步驟：(1)以菊花無菌苗莖段為外植體，在預培養基中誘導培養4～7d，得愈傷組織；所述預培養基以B5培養基為基本培養基，還包括：2～3mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖和9～12g/L瓊脂，pH 5.8～6.2；

(2)將農桿菌接種到含有50mg/L利福平的YEB培養基中，于28℃，180rpm條件下振蕩培養24h后，將得到的菌液接種到新鮮的YEB培養基中，于28℃下，180rpm條件下振蕩培養至OD₆₀₀為0.6～0.8，得農桿菌菌液；所述農桿菌中含有目的基因和篩選基因質粒；

(3)將乙酰丁香酮與所述愈傷組織和農桿菌菌液混合侵染8～20min，得侵染愈傷組織；

(4)將所述侵染愈傷組織接種于共培養培養基中進行共培養，得共培養愈傷組織；所述共培養培養基以B5培養基為基本培養基，還包括：2～3mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L瓊脂和100～200μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.8～6.2；

(5)將所述共培養愈傷組織接種至篩選培養基中進行篩選分化培養，得不定芽；所述篩選培養基以B5培養基為基本培養基，還包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L瓊脂、200～400mg/L羧芐青霉素和20～40mg/L潮霉素，pH 5.8～6.2；