[發明專利]一種農桿菌介導的菊花轉染體系的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201911409984.8
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110904147A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 周旭紅;楊曉密;葉世隆;李姝影;曹磊;毛羽;羅柯佳
• 申請（專利權）人: 云南中醫藥大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/14
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 呂紀濤

1.一種農桿菌介導的菊花轉染體系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)以菊花無菌苗莖段為外植體，在預培養基中誘導培養4～7d，得愈傷組織；所述預培養基以B5培養基為基本培養基，還包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖和9～12g/L瓊脂，pH 5.8～6.2；

(2)將農桿菌接種到含有50mg/L利福平的YEB培養基中，于28℃，180rpm條件下振蕩培養24h后，將得到的菌液接種到新鮮的YEB培養基中，于28℃下，180rpm條件下振蕩培養至OD₆₀₀為0.6～0.8，得農桿菌菌液；所述農桿菌中含有目的基因和篩選基因質粒；

(3)將乙酰丁香酮與所述愈傷組織和農桿菌菌液混合侵染8～20min，得侵染愈傷組織；

(4)將所述侵染愈傷組織接種于共培養培養基中進行共培養，得共培養愈傷組織；所述共培養培養基以B5培養基為基本培養基，還包括：2～3mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L瓊脂和100～200μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.8～6.2；

(5)將所述共培養愈傷組織接種至篩選培養基中進行篩選分化培養，得不定芽；所述篩選培養基以B5培養基為基本培養基，還包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L瓊脂、200～400mg/L羧芐青霉素和20～40mg/L潮霉素，pH 5.8～6.2；

(6)將所述不定芽接種于擴繁培養基中進行擴繁培養，得轉基因菊花；所述擴繁培養基以B5培養基為基本培養基，還包括：0.3～0.5mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L瓊脂和10～20mg/L潮霉素，pH 5.8～6.2；

步驟(1)和(2)之間不存在時間上的先后關系。

2.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(1)所述菊花無菌苗莖段的厚度為0.5～2mm。

3.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(1)所述誘導培養的溫度為23±2℃，光照強度為2000～3000Lux，光照時間為10～12h/d。

4.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(3)所述混合侵染時，所述乙酰丁香酮的濃度為100～200μmol/L。

5.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(4)所述共培養的溫度為23±2℃，共培養的時間為3～4天。

6.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(5)所述篩選分化培養的溫度為23±2℃，篩選分化培養的時間為2～3個月。

7.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(6)所述擴繁培養的溫度為23±2℃，擴繁培養的時間為1～2個月。

8.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(6)得轉基因菊花后，還包括對所述轉基因菊花進行PCR檢測。

9.根據權利要求8所述構建方法，其特征在于，所述PCR檢測以所述轉基因菊花的基因組DNA為模板，特異性引物根據步驟(2)所述目的基因設計。

10.權利要求1～9任一項所述構建方法在菊花育種中的應用。