[發明專利]一種土壤中噬菌體提取富集的方法

在審

• 申請號: 201911409962.1
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110904057A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 孫明明;鄭曉璇;晁會珍;王鑫偉;胡鋒
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/92
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

一種土壤中噬菌體提取富集的方法，首先將鮮土以一定比例與檸檬酸鉀緩沖液混合，放置于低溫孵化一段時間，然后提取液將通過超聲震蕩處理從土壤顆粒中提取土壤噬菌體。土壤懸濁液經多次離心操作后取得上清液，經滅菌濾膜依次過濾除菌后，使用切向流過濾/超濾技術縮小濾液體積，進行噬菌體富集。使用聚乙二醇沉淀的方式回收噬菌體，低溫放置過夜，第二天經離心、TE緩沖液溶解后再次過濾膜除菌，使用核酸酶消化樣品中的雜質DNA和RNA。最終得到的濃縮液可以進行后續DNA提取及樣品固定等操作。

技術領域

本發明屬于土壤生物學領域，尤其涉及一種土壤中噬菌體提取富集的方法。

背景技術

侵染原核微生物的病毒被稱為噬菌體，是目前已知自然環境中豐度最大的生物體；且由于土壤中原核微生物（細菌和古菌）的數量遠大于真核生物，因此噬菌體是土壤中主要的病毒類群。噬菌體通過吸附、注入、增殖（復制與生物合成）、成熟（裝配）和釋放五個階段，完成對宿主細菌的捕食，在土壤中發揮著重要作用：噬菌體裂解細菌，影響細菌生理代謝，從而影響生態系統中微生物的群落結構及多樣性；細菌裂解后釋放有機物將影響元素的生物地球化學循環；細菌DNA由于裂解釋放到環境中或者被噬菌體轉移，引起微生物遺傳變異，推動微生物種群進化。因此，土壤噬菌體群落在生態系統中扮演著重要角色。另外，由于噬菌體專性裂解細菌的特性，有關于噬菌體的研究工作多從實用角度出發，如在病原菌檢測、控制生物膜污染、噬菌體療法防治細菌性疾病或病害等方面，噬菌體均顯現出巨大潛力。然而，由于土壤環境的復雜性，大部分噬菌體被土壤顆粒吸附而固定，其他部分以溶原狀態存在于寄主細菌中，只有極少部分噬菌體以游離狀態存在，目前未有可靠的辦法能夠從土壤中高效地提取、富集噬菌體。因此研究高效、穩定地土壤噬菌體提取方法是進一步了解土壤環境生物結構功能，促進土壤噬菌體的研究、應用的必要保證。

目前，針對噬菌體的研究，大多采用特定細菌靶向篩選出對應噬菌體的形式。其中，申請號：CN201610377461.X提供了一種快速篩選噬菌體的方法，該方法通過懸濁液過濾離心的方式獲得噬菌體溶液，將細菌在固體平板上以劃平行長線的方式接種后，再將噬菌體懸液以劃平行短線的方式垂直于細菌長線接種，使細菌和噬菌體形成垂直交叉，所得培養皿置于生長條件下12-36小時之后，若在細菌和噬菌體的交叉處有裂解現象，則將板內對應的噬菌體再次與宿主菌混合擴大培養。但該技術的前提為細菌已被培養出，因此得到的噬菌體種類單一，不能展示土壤噬菌體群落的全貌；無法對不可培養細菌進行噬菌體篩選，也限制了實用性。

通過專利檢索，未發現有關提取、富集土壤噬菌體的方法公開發表和受理，與本發明最接近的現有技術是從糞便或污泥中提取富集噬菌體的方法。申請號：CN201910280829.4提供了一種從好氧顆粒污泥中高效提取富集噬菌體的方法，該方法對污泥研磨后加入糖化水解酶去除胞外聚合物、釋放噬菌體，而后震蕩提取、濃縮，得到噬菌體顆粒，污泥與土壤環境相比富含大量水分和胞外聚合物，胞外聚合物被水解后噬菌體可以很快釋放到水相中；而土壤因缺少游離水和較強的靜電吸附作用，必須選擇添加合適的緩沖提取液將噬菌體轉移至水相中。申請號：CN201810394101.X提供了一種從糞便中獲得噬菌體的方法，其采用糞便和SM緩沖液混合后渦旋震蕩的方式，將糞便中的噬菌體釋放到緩沖液中，而后過濾、富集。而土壤由于所需樣品量大、提取液用量多， 由于SM緩沖液中含有分子量為幾萬至十幾萬的明膠，使用起來將過膜困難，操作耗時耗力；且后期噬菌體富集過程中，采用100kDa超濾孔徑會使大量土壤噬菌體通過濾膜，噬菌體獲得率低。因此，這兩種方法均不適用于土壤中的噬菌體提取與富集。

發明內容

解決的技術問題：本發明提供了一種土壤中噬菌體提取富集的方法，該方法可以有效地對土壤噬菌體進行提取，便于后續研究對土壤噬菌體群落的調查與利用。將超聲后的土壤噬菌體浸提液過濾除菌、切向流與聚乙二醇沉淀進行富集，獲得的噬菌體可以最大化展示土壤噬菌體群落全貌，是一種操作簡便且準確的方法。