[發明專利]一種土壤中噬菌體提取富集的方法

在審

• 申請號: 201911409962.1
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110904057A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 孫明明;鄭曉璇;晁會珍;王鑫偉;胡鋒
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/92
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

1.一種土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于包括以下步驟：按比例，將300g處理后的鮮土與1L 1wt.%檸檬酸鉀緩沖液混合，放置于4℃低溫孵化15分鐘，使土壤樣品分散，將其在冰浴環境下超聲處理后，離心取上清，然后通過0.45μm和0.22μm無菌濾膜依次進行過濾除菌；除菌濾液使用切向流過濾技術進行濃縮后得到的噬菌體富集液，再使用聚乙二醇沉淀的方式回收噬菌體并用1×TE緩沖液重懸，再次過0.22μm無菌濾膜除菌后使用DNaseI和RNase核酸酶降解樣品中的游離DNA和RNA，去除宿主菌污染，最終得到噬菌體濃縮液。

2.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于所述鮮土去除雜質。

3.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于所述1%檸檬酸鉀緩沖液每升含有：10g C₆H₅K₃O₇，1.92g Na₂HPO₄·12H₂O，0.24g KH₂PO₄，pH=7。

4.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于超聲處理具體方式為：冰浴超聲處理3分鐘，且每經過1分鐘超聲，都需將提取液從冰浴拿出，手動搖晃30s；超聲條件為100 W，47 kHz。

5.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于經超聲處理后的離心操作為：7000rpm離心10分鐘取得上清液，將上清液轉移至新鮮瓶中并再以7000rpm離心15分鐘。

6.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于富集噬菌體所使用的切向流過濾技術，使用膜包為：Sartorius Vivaflow50 30000MWCO PES膜，流速條件為：200mL/min。

7.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于富集噬菌體所使用的切向流過濾技術需要將除菌濾液縮小體積至30mL。

8.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于所述富集液使用的聚乙二醇(PEG)沉淀回收噬菌體的具體方法為：加入固體氯化鈉至富集液終濃度為0.5mol/L，攪拌使其溶解后冰浴1小時，冰浴后于4℃下8000rpm離心10分鐘，收集上清；上清液加入固體PEG 8000至終濃度為10wt.%后，在室溫下使用磁力攪拌器攪拌至溶解，而后4℃過夜放置。

9.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于所述PEG沉淀后溶解所用的1 x TE緩沖液配方為：1M pH=8.0 Tris-HCl Buffer，1mL；0.5M pH=8.0 EDTA，0.2mL；向燒杯中加入80mL的ddH₂O均勻混合；將溶液定容到100mL后，高溫高壓滅菌；室溫保存。

10.根據權利要求1所述土壤中噬菌體提取富集的方法，其特征在于核酸酶降解的具體方法為：將DNase I Buffer:DNase I: RNase按質量比20:2:1混合后，保證DNase I加入回收液的終濃度為20 U/mL，37℃酶消解30分鐘后，70℃滅活10分鐘。