[發明專利]一種殼聚糖酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201911409831.3
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111041017B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 公衍軍;石琨
• 申請（專利權）人: 濰坊麥卡阿吉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/00;C12P19/04;C12P19/12;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

本發明涉及基因工程改造，具體的說是一種殼聚糖酶突變體及其應用。殼聚糖酶突變體為殼聚糖酶BC345氨基酸序列第116位點上的絡氨酸Y突變成丙氨酸A，所述殼聚糖酶BC345突變體氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，或，殼聚糖酶BC345氨基酸序列第116位點上的絡氨酸Y突變成丙氨酸A，且殼聚糖酶BC345突變體氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A。本發明所用的殼聚糖酶突變體活性高，耐高溫。并對該殼聚糖酶進行理性改造，通過定點突變和增加柔性片段的方法大大提高了其酶活及其熱穩定性，使得該酶具有了工業化生產殼寡糖的潛力。

技術領域

本發明涉及基因工程改造，具體的說是一種殼聚糖酶突變體及其應用。

背景技術

殼聚糖是甲殼素脫去乙酰基后的產物，是自然界中唯一存在的堿性多糖，具有生物可降解、對動物無毒害、可溶于酸性溶液、可獲得多種物理形式并且更容易處理等特點。殼聚糖在多種領域都有應用，但一般制得的殼聚糖分子量都很大，而大分子殼聚糖不溶于水且不能發揮殼寡糖的一些特殊功能，因此，殼聚糖需要進一步通過化學法或酶法降解成殼寡糖。殼寡糖具有水溶性好、無毒性、與生物體兼容、環境友好型、易被生物體降解等特性，目前廣泛用于醫藥衛生、保健食品、食品加工、化妝品、紡織、環保、農業、飼料等領域。

殼聚糖酶可以水解殼聚糖中的β-1，4-糖苷鍵，將殼聚糖降解。已發現的殼聚糖酶絕大部分為內切酶，可以將殼聚糖降解為殼寡糖。目前研究最多的是來源于細菌和真菌的殼聚糖酶。并且現階段，制備殼寡糖的方法主要有化學降解法、物理降解法和酶降解法等。化學降解法產生的衍生物較多，低聚糖得率低且環境污染嚴重；物理降解法生產成本較高，難以實現工業化；酶法因條件溫和、選擇性高，對環境污染小，產物安全性好，受到了越來越多的重視與關注。如今，酶法水解殼聚糖制備殼寡糖已成為甲殼素領域的一個研究熱點。

酶法降解殼聚糖有諸多的優點，但是這種方法還是存在有待提高的方面，第一方面是殼聚糖酶的酶活力普遍較低；第二方面是酶的熱穩定性有待提高。這兩方面制約了酶法降解殼聚糖向大規模工業發展。本發明涉及的一種來自人體腸道微生物菌株產生的降解殼聚糖的殼聚糖酶，其特征在于酶活力高，熱穩定性強，具有廣闊的應用前景。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術中存在的不足的之處，提供一種熱穩定性好、酶活高的殼聚糖酶突變體。

一種殼聚糖酶突變體，突變體為殼聚糖酶BC345氨基酸序列第116位點上的絡氨酸Y突變成丙氨酸A，所得突變體(BC345/Y116A)，其氨基酸序列如下SEQ ID NO:4所示；

或，所述殼聚糖酶BC345突變體氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突變體(BC345PA)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

或，殼聚糖酶BC345氨基酸序列第116位點上的絡氨酸Y突變成丙氨酸A，且殼聚糖酶BC345突變體氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突變體(BC345/Y116A/PA)其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

所述殼聚糖酶BC345為人腸道菌Bacteroides clarus YIT 12056菌株基因組DNA中殼聚糖酶BC345。

一種殼聚糖酶突變體用于降解殼聚糖生產殼寡糖的應用。

一種重組質粒，所述重組為含所述殼聚糖酶的基因的質粒。

所述質粒載體為pPCIZα。

一種含所述重組質粒的基因工程菌株。

所述重組質粒轉化至畢赤酵母中獲得。

一種所述基因工程菌株殼聚糖酶用于降解殼聚糖生產殼寡糖的應用。