[發明專利]一種從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201911409750.3
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110904031A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 蘇愛盟;肖桂清;徐峰波;唐燕程;謝燕萍
• 申請（專利權）人: 福建省銀豐干細胞工程有限公司;銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/0775
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明公開了一種從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞的方法，屬于細胞生物學技術領域。該方法從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞并進行傳代培養，細胞收獲、凍存，細胞的STR鑒定，最終獲得細胞產品。本發明在分離、培養過程中采用改良的分離方法和培養體系減少對細胞的傷害，提高分離效率，縮短培養周期并能獲得高純度、表征優良的細胞。

技術領域

本發明屬于細胞生物學技術領域，具體涉及一種從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一類具有多向分化潛能、低免疫原性的成體干細胞，具粘附性，呈紡錘型、成纖維細胞樣形態，在胚胎發育中來源于中胚層，具有分化為多種中胚層細胞系的潛能，包括骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、肌腱細胞等，具有巨大的潛在醫療和存儲價值。MSCs廣泛地存在于人體的骨髓、脂肪、牙周膜、新生兒的臍帶、胎盤、羊膜、羊水等組織中，在經過多次分裂傳代后仍保持多向分化潛能，至今為止的臨床試驗研究未發現MSCs有嚴重副作用，是一種非常理想的細胞治療和再生醫學的種子細胞。

胎盤底蛻膜間充質干細胞（Placental decidua basalis derived mesenchymalstem cells，PDB-MSCs）是從胎盤底蛻膜組織中分離得到的一種母親來源的、具有多向分化潛能的干細胞。胎盤的羊膜和絨毛膜都可以提取出間充質干細胞，作為小孩自身細胞的移植或凍存。而胎盤的蛻膜提取出來的間充質干細胞，來源于母體，能用于母親自身細胞的移植或凍存，具有針對性。目前蛻膜間充質干細胞已經應用于再生治療,具有較高的臨床應用價值。

綜上所述，胎盤底蛻膜間充質干細胞在采集、儲存、現實應用、潛力開發等方面都有非常突出的優勢。目前，胎盤底蛻膜間充質干細胞的分離制備工藝復雜；更為重要的是，目前大部分技術未對分離出的PDB-MSCs進行來源鑒定，存在樣本來源不確定的問題。

現有技術方法中，多采用酶消化法進行PDB-MSCs分離，盡可能的獲得純度較高的PDB-MSCs的細胞群；在培養時添加兩性霉素等抗生素，雖然能防止污染，但也對細胞造成不同程度的傷害且在使用上存在一定爭議。PDB-MSCs的分離培養過程操作復雜、耗時長、生產成本較高。除此之外，大部分技術方案未對所分離細胞進行鑒定，存在細胞來源不確定、細胞成分不單一、安全性不足等問題。總的來說，PDB-MSCs的分離、培養方法和鑒定方面都有較大的改善空間。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞的方法。該方法既能獲得優質的胎盤底蛻膜間充質干細胞，減少對細胞的傷害，縮短了培養周期，減少污染，而且能夠提高細胞純度，保證細胞來源。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞的方法，包括以下步驟：

（1）胎盤底蛻膜間充質干細胞制備；從各項傳染病檢測均合格的母體，收集胎盤組織及母血樣本，無菌儲運；樣本初步檢查；母血樣本分裝，胎盤組織進行無菌清洗后撕取底蛻膜組織，將底蛻膜組織剪碎均勻鋪于T175培養瓶中，在培養箱中水平放置2小時后加入MSC完全培養基，靜止培養7天后，進行換液處理；待細胞量≥60%-70%進行傳代處理；

（2）胎盤底蛻膜間充質干細胞的傳代培養；取出準備傳代的胎盤底蛻膜間充質干細胞細胞，吸掉培養基；加0.25%胰酶消化細胞，終止消化，將細胞輕柔吹吸后轉移至離心管中，并用生理鹽水洗滌培養瓶一次，將洗滌的細胞轉移至離心管中離心；吸棄離心后的上清，用無血清培養基重懸細胞沉淀，臺盼蘭染色細胞計數，調整細胞密度為4.0×10⁵/ml，每個T175培養瓶先加23.0ml MSC完全培養基，再加2.0ml細胞懸液，混勻后放置于培養箱中靜止培養；