[發明專利]一種從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201911409750.3
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110904031A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 蘇愛盟;肖桂清;徐峰波;唐燕程;謝燕萍
• 申請（專利權）人: 福建省銀豐干細胞工程有限公司;銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/0775
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

1.一種從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

胎盤底蛻膜間充質干細胞制備；從各項傳染病檢測均合格的母體，收集胎盤組織及母血樣本，無菌儲運；樣本初步檢查；母血樣本分裝，胎盤組織進行無菌清洗后撕取底蛻膜組織，將底蛻膜組織剪碎均勻鋪于T175培養瓶中，在培養箱中水平放置2小時后加入培養基，靜止培養7天后，進行換液處理；待細胞量≥1×10⁶時，進行傳代處理；

（2）胎盤底蛻膜間充質干細胞的傳代培養；取出準備傳代的胎盤底蛻膜間充質干細胞細胞，吸掉培養基；加0.25%胰酶消化細胞，終止消化，將細胞輕柔吹吸后轉移至離心管中，并用生理鹽水洗滌培養瓶一次，將洗滌的細胞離心；吸棄離心后的上清，用無血清培養基重懸細胞沉淀，臺盼蘭染色細胞計數，調整細胞密度為4.0×10⁵/ml，每個T175培養瓶先加23.0ml MSC完全培養基，再加2.0ml細胞懸液，混勻后放置于培養箱中靜止培養；

（3）細胞收獲、凍存；細胞生長至80~90%時對細胞進行消化，消化的細胞洗滌、離心，收集細胞沉淀，取樣進行檢測，檢測合格后重懸細胞，收獲包裝并凍存；凍存程序為：a．在4℃等待，直至產品放入；b. 以1℃/min降至0℃，保持5min；c．以1℃/min降至-10℃，保持5min；d．以1℃/min降至-45℃，保持20min；e．以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.結束；

（4）STR鑒定樣本準備：步驟（1）中分裝的母血樣本中的母血球用于STR鑒定的母體樣本；取1×10⁴的P2代細胞鋪于1個T25培養瓶中，待細胞生長到60%-70%時，加入足量MSC完全培養基，使培養基充滿整個培養瓶；將上述母血球和T25培養瓶中的細胞做好標注，一同寄往檢測機構檢測。

2.根據權利要求1所述的一種從人胎盤底蛻膜組織中分離母體來源間充質干細胞的方法，其特征在于，所述步驟（1）胎盤底蛻膜間充質干細胞制備，包括以下具體步驟：

1）樣本篩選及采集：選取各項傳染病檢測均合格的客戶，剖腹產后收集胎盤組織及母血樣本5ml；胎盤用生理鹽水沖洗后置于無菌采集袋中，倒入500ml胎盤儲運液，封口，再將無菌采集袋置于生物安全樣本袋中，放置于儲運盒內，在4-10℃條件下運送至實驗室；所述胎盤儲運液配方為：500ml PBS+ 320U/ml硫酸慶大霉素+25μg/ml兩性霉素B；

2）樣本初步檢查：開箱檢查儲運液有無滲漏，胎盤儲運袋及母血抗凝管標簽是否完整、準確，交接表內容是否齊全；

3）母血樣本分裝：準備EP管并粘貼條碼，其中7個EP管標注母血“m”，將母血采用1500rpm/5min離心后分裝，離心母血并分裝上清液，裝入4支EP管中， 1支按照第三方檢測單次檢測用量需要分裝后送檢，用于傳染病五項和ALT檢測；剩余血漿平分至3支EP凍存用于復核復檢，每支0.5m~1ml；母血球轉到另外3支EP管中，與母血漿一起冷凍保存，登記樣本儲存位置；

4）胎盤組織進行無菌清洗：準備2支50mL離心管分別加入20mL 75%醫用酒精，作為工具放置管，分別插入1把醫用剪刀和2把醫用鑷子；將無菌袋表面噴酒精消毒后置無菌臺，將無菌袋近1/2 處正反兩次折疊，并分別用浸潤有醫用酒精的無塵紙消毒，用第一套工具管中的剪刀將無菌袋從折疊線處剪開；將儲運液盡可能完全倒棄，加入生理鹽水300mL，手持無菌袋兩側使胎盤樣本在生理鹽水洗液中充分蕩洗，在無菌袋中重復加入生理鹽水清洗3次，每次清洗應將前一次液盡可能倒棄完全；在無菌袋中清洗胎盤樣本3次后，轉至無菌不銹鋼盒中繼續加生理鹽水清洗，每次加入生理鹽水300mL，清洗3次；

5）撕取底蛻膜組織：將清洗后的胎盤組織放置于裝有10ml生理鹽水的50ml離心管中，加20mL生理鹽水清洗組織塊至少5次，每次清洗后將組織轉移至新的離心管中繼續蕩洗；用鑷子去除底蛻膜上的紅色組織，只留下白色且略透明的底蛻膜組織；充分剪碎底蛻膜組織塊，將組織塊均勻鋪于T 75培養瓶中，在培養箱中水平放置2小時后加入15ml MSC完全培養基；靜止培養7天后，進行換液處理；待細胞量≥1×10⁶進行傳代處理；所述 MSC完全培養基配方為：無血清培養基+5ng/ml EGF+7ng/ml PDGF + 5ng/ml FGF+5ng/ml IFN-γ+ 5ng/mlTNF-α+2% L-GlutaMAX。