[發(fā)明專利]一種黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產酸性蛋白酶的生產工藝

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• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110904083A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設計）人: 周長春;房華;周鳳云;李敦貴;左權;黃敬尊;崔成岺
• 申請（專利權）人: 沂源康源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N1/14;C12R1/685
• 代理公司: 淄博川誠知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 37275
• 代理人: 劉子成

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產酸性蛋白酶的生產工藝，固體發(fā)酵通過菌種的篩選，正常酶活力可做到7萬U/g以上，通過工藝設計優(yōu)化，參數調整，最終產出酸性蛋白酶酶活力達到8?10萬U/g。通過菌種優(yōu)化縮短發(fā)酵周期、通過工藝優(yōu)化(淺盤發(fā)酵)雜菌率降低2?3個數量級(100?1000倍)，既保障了產品質量，又極大降低了生產成本，更適用于工業(yè)化生產要求。同時固體發(fā)酵酸性蛋白酶帶培養(yǎng)基一塊粉碎包裝銷售，利用率高，無廢棄料、下腳料，做到100％全利用。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產酸性蛋白酶的生產工藝。

背景技術

酸性蛋白酶是一類最適pH值為2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相對分子質量為30000—40000。酸性蛋白酶主要來源于動物的臟器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根據其產生菌的不同，微生物蛋白酶可分為霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和擔子菌酸性蛋白酶。根據作用方式可分為兩類：一類是與胃蛋白酶相似，主要產酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一類是與凝乳酶相似，主要產酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有較好的耐酸性，因此被廣泛地應用于食品、醫(yī)藥、輕工、皮革工藝以及飼料加工工業(yè)中。

國外關于酸性蛋白酶的研究和生產從20世紀初就開始了。乞今為止，已發(fā)現不少微生物可以產生酸性蛋白酶，如黑曲霉(Aspergillus niger)、大孢子黑曲霉突變株(A.niger var.macrosporus)、齋藤曲霉(A.saitoi)、宇佐美曲霉(A.usamii)、泡盛酒曲霉(A.awamori)、微紫青霉(Pen.janthinellum)、根霉(Rhizopus sp.)等。1903年，德國科學家從動物的胰臟中提取出胰蛋白酶，并將其用于皮革的柔制。自1954年吉田首次發(fā)現黑曲霉可產生酸性蛋白酶以來，國內外開始對微生物發(fā)酵生產酸性蛋白酶進行了廣泛的研究。到目前為止，國外科學家對酸性蛋白酶的結構和功能等已經進行了廣泛系統(tǒng)的研究。

我國從上世紀60年代就開始微生物產酸性蛋白酶相關研究生產，早期生產的微生物酸性蛋白酶，只是工業(yè)級的，主要用于皮毛軟化。微生物菌種通過液體通風發(fā)酵，成熟發(fā)酵醪再經硫酸銨鹽析、板框壓濾、氣流(沸騰)干燥、粉碎、化驗、包裝制成工業(yè)級酸性蛋白酶。近年來國內在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于選育產酶活力高、抗逆性好的菌種。目前國內生產酸性蛋白酶的廠家用酸性蛋白酶生產的菌種主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它們突變株，存在酸性蛋白酶菌種發(fā)酵活力較低，生產工藝較繁雜，微生物指標不穩(wěn)定，生產成本高等問題。

發(fā)明內容

針對以上情況與行業(yè)現狀，申請人通過大量的菌種選育、工藝設計優(yōu)化，發(fā)明出一種黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產酸性蛋白酶的生產工藝，固體發(fā)酵相較傳統(tǒng)的液體發(fā)酵，伴生酶系更加全，使用效果好，更受市場青睞，同時克服了普通固體發(fā)酵工藝成熟度低，雜菌率高，酶活力低的難題。

本發(fā)明所述的一種黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產酸性蛋白酶的生產工藝，其特征在于包括以下步驟：

(1)試管斜面菌種制備：

斜面培養(yǎng)基包括蔗糖3％、硝酸鈉0.2％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂：0.05％氯化鉀0.05％、硫酸亞鐵0.01％、瓊脂2％，調節(jié)Ph6.0～6.2，電爐上加熱煮沸充分溶解，用玻璃移液管吸培養(yǎng)基分裝到的玻璃試管中，塞好棉塞，用紙包好，在121℃、0.1Mpa條件下滅菌30min，滅菌完成后試管傾斜置于超凈臺內，冷卻凝固，斜面占試管長度的2/3，將黑曲霉菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；

(2)搖瓶菌種制備：

搖瓶培養(yǎng)基包括葡萄糖4％、酵母粉0.3％、豆餅粉1％、磷酸二氫鉀0.2％、硫酸鎂0.02％，控制Ph5.5～6.0，在121℃、0.1Mpa條件下滅菌30min，冷卻，斜面試管接種于搖瓶中進行培養(yǎng)；

(3)種子罐菌種擴繁：