[發明專利]口蹄疫病毒核酸免提取熒光等溫擴增檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201911406995.0
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN113122656A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 北京森康生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明選擇口蹄疫病毒高度保守的3D基因片段作為檢測靶基因，設計特異性引物建立FMDV特異性的熒光等溫擴增檢測方法。本發明采用Bst DNA聚合酶，具有擴增效率高、特異性好的優點；采用熒光染料指示反應結果，便于準確判定；無需提取樣品DNA,簡化了檢測操作；整個檢測過程速度快，只需50min。且本發明一次可檢測多個樣品，適于大批樣品的檢測。所用的熒光恒溫擴增儀器成本低；具有擴增效率高、特異性好的優點；可以用于動物血液和組織中的口蹄疫病毒檢測。

技術領域

本發明涉及一種口蹄疫病毒核酸熒光等溫擴增檢測技術及成套試劑盒，屬于微生物檢測技術領域。

背景技術

口蹄疫是由口蹄疫病毒 (foot-and-mouth disease virus, FMDV) 引起的, 發生于牛、羊、豬等偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。世界動物衛生組織將口蹄疫列為必須報告的動物烈性傳染病, 嚴重危害畜牧業的發展及相關產品對外貿易。患口蹄疫的動物特征是:會出現發熱、跛行和在皮膚與皮膚黏膜上出現水皰等癥狀。惡性口蹄疫還會導致迅速死亡。

發病或處于潛伏期的動物是主要的口蹄疫病毒傳染源，該病毒可通過空氣、分泌物和排泄物，以及被污染的飼料等多種途徑傳播。對口蹄疫的控制措施包括：強化滅活疫苗免疫接種；加強疫情監測和報告，建立有效的主動檢測、預報、預警機制；建立健全應急機制，完善應急預案；嚴格對移動動物、動物產品的檢疫監管。

口蹄疫病毒檢測是開展疫病診斷和檢疫的重要依據。病毒感染相關抗原（VIAA）瓊脂擴散試驗主要用于疫情普查和活畜進出口檢疫，僅能對動物是否存在口蹄疫病毒感染抗體進行檢測，耗時一天以上。

當前各級獸醫實驗室在檢測口蹄疫病毒時，主要采用普通RT-PCR方法和熒光RT-PCR方法，但普通RT-PCR檢測操作容易造成病毒核酸擴增產物的污染，造成假陽性；而熒光RT-PCR技術則需要價格昂貴的熒光PCR儀，從核酸提取到完成全部檢測過程，通常需要2個小時以上。近年來我國對動物及其產品檢疫要求開展病原學檢測，依據檢測結果出具檢疫證明，這就需要更快速、簡便、準確、低廉并適合在現場應用的FMDV檢測技術。

核酸等溫擴增技術是一種新興的基因檢測技術,與廣泛應用的普通RT-PCR和熒光RT-PCR相比，具有許多優點。該方法不需要貴重儀器（恒溫即可）、操作簡單、速度快、靈敏度高，因此得到越來越廣泛的應用。但現有的核酸等溫擴增方法，主要依靠肉眼觀察反應溶液的顏色變化來判定結果，其主觀性強、準確性差。

本發明采用熒光劑對雙鏈DNA擴增產物進行染色，用閱讀儀檢測熒光信號來判定結果，比眼觀法提高了準確性；本發明采用免提取反應液，處理并釋放樣品中的病毒RNA，直接進行擴增反應，不必提取樣品中的RNA，減少了操作步驟和成本，縮短了檢測時間，消除了核酸提取過程中的交叉污染；本發明針對口蹄疫病毒基因設計了6條特異性引物，從而保證擴增反應的特異性。

本發明綜合運用這些技術，最終建立了新的口蹄疫病毒核酸快速檢測方法和試劑盒。本發明相比目前廣泛使用的PCR和熒光PCR檢測方法，具有檢測速度快、靈敏度高、操作簡便、試劑與設備成本低等優點，適合在動物養殖、屠宰、檢疫、監測的現場和基層單位使用，具有良好應用前景。

發明內容

本發明的目的是建立免提取核酸的口蹄疫病毒熒光等溫擴增檢測方法及試劑盒，使檢測過程簡便易行，結果判讀精確，不用借助昂貴儀器，降低檢測成本，檢測總時間縮短至50分鐘，為口蹄疫病毒檢測提供快速、靈敏、特異、低成本的技術手段。

為實現上述發明目的，本發明綜合運用Bst DNA聚合酶等溫擴增技術、組織樣本核酸免提取技術和熒光指示劑，建立口蹄疫病毒熒光等溫擴增檢測方法，研制成試劑盒，具體內容如下：

1.等溫擴增引物設計：參考口蹄疫病毒基因組的核苷酸序列，篩選3D基因保守區域，設計6條引物：

FMDF3 ACCCTCGARGCTATC

FMDB3 GCGTCACCGCACAC