[發(fā)明專利]口蹄疫病毒核酸免提取熒光等溫擴(kuò)增檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911406995.0
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN113122656A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權(quán)）人: 北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
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• 代理人: 暫無信息

1.一種快速檢測口蹄疫病毒的核酸免提取的熒光等溫擴(kuò)增試劑盒，包括6條特異性引物，其核苷酸序列如下：

FMDF3 ACCCTCGARGCTATC;SEQ ID NO.1;

FMDB3 GCGTCACCGCACAC;SEQ ID NO.2;

FMDFIP TGGACGGCAAGTCCTGTTTTCTCTCCTTTGCACG;SEQ ID NO.3;

FMDBIP TACCGGCGTCTCTTTGATTTTCACCCAACGCAGG;SEQ ID NO.4;

FMDLF CAACTTCTCCTGTATGGTCC;SEQ ID NO.5;

FMDLB TGAGATTCCAAGCTACAGAT;SEQ ID NO.6。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，還包熒光等溫擴(kuò)增免提取反應(yīng)液（內(nèi)含SYBR GreenI熒光染色劑）、Bst DNA聚合酶、陰性對照、陽性對照以及礦物油中的一種或多種。

3.一種口蹄疫病毒核酸免提取熒光等溫擴(kuò)增檢測試劑盒的制備方法，具體包括：

（1）引物溶液配制：按權(quán)利要求1所述核苷酸序列合成引物，將人工合成引物FMDF3、FMDB3、FMDFIP、FMDBIP用DEPC處理水稀釋至20μmol/L，將人工合成引物FMDLF、FMDLB用DEPC處理水稀釋至40μmol/L；將稀釋后的引物按FMDF3:FMDB3:FMDFIP:FMDBIP:FMDLF:FMDLB=1:1:8:8:2:2的比例混勻；

（2）熒光等溫擴(kuò)增免提取反應(yīng)液的制備：0.1%SYBR GreenI液0.5 mL、10倍濃度反應(yīng)緩沖液2.5 mL、引物液5.5 mL、5 mol/L甜菜堿溶液4 mL、10 mmol/L dNTP Mixture 3.5 mL、100 mmol/L MgSO₄溶液1.5 mL、0.1%DEPC處理水4.5 mL，混勻后用濾膜除菌，分裝成小管；

（3）Bst DNA聚合酶的制備：濃度為8U/μL，按1000μL/管無菌分裝；

（4）制備陽性對照：以常規(guī)方法克隆口蹄疫病毒基因的序列，構(gòu)建pMD20-T-FMDV載體質(zhì)粒，對質(zhì)粒中的5'UTR基因進(jìn)行序列測定；測序結(jié)果正確后，轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒作為陽性對照；

（5）經(jīng)過優(yōu)化的反應(yīng)條件為：在反應(yīng)管中加入熒光等溫擴(kuò)增免提取反應(yīng)液22μL和BstDNA聚合酶1.0μL，加入20μL礦物油，再加樣品2.0μL（無需預(yù)先提取核酸）；反應(yīng)條件參數(shù)為64℃、50min，每分鐘收集一次熒光信號。

4.權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測動物血液和動物組織內(nèi)口蹄疫病毒中的應(yīng)用。