[發(fā)明專利]一種通過耳道念珠菌細胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法

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• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111679069A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵菁;劉娟娟;潘敏;陳夢麗;李倩倩;汪天明;吳大強;馬克龍;顏貴明;汪長中
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N1/14;C12R1/72
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

一種通過耳道念珠菌細胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法，包括將中藥單體加入至評價菌液，孵育12h后用無菌PBS洗滌一次，再用無菌PBS配制的質(zhì)量分數(shù)為2%的BSA封閉1小時，再然后用無菌PBS洗滌一次；接下來加入100ul的β?葡聚糖抗體，放在4°C冰箱進行染色4h，染色結(jié)束后，用無菌PBS洗滌2次，再用cy3單抗鼠標記IgG在室溫下避光染色1小時，然后用無菌PBS避光洗滌3次后用1ml的無菌PBS進行避光重懸，避光震蕩混勻后用流式細胞儀進行葡聚糖熒光暴露強度的檢測；或者用流式細胞儀進行幾丁質(zhì)熒光暴露強度的檢測；或者用倒置熒光顯微鏡記錄β?葡聚糖與幾丁質(zhì)熒光圖像。本發(fā)明利用耳道念珠菌細胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用，具有臨床意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過耳道念珠菌細胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法。

背景技術(shù)

耳道念珠菌(Candida auris)自從2009年被發(fā)現(xiàn)至今,已對全球性人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。近年來耳道念珠菌感染日益常見，特別是在長期住院或免疫功能低下的患者中，嚴重者可致死亡。目前，相比于耐藥性細菌感染或病毒爆發(fā)，耳道念珠菌感染較少受重視，耳道念珠菌耐藥性機制研究和新型抗真菌藥物的研發(fā)尚無可觀性進展。在此情況下，耳道念珠菌對有限的抗真菌藥物耐藥性的增加是一個當(dāng)今社會必須面臨的嚴重問題，多重耐藥耳道念珠菌的出現(xiàn)是一種全球健康威脅。念珠菌引起的侵襲性真菌感染對全球衛(wèi)生保健來說仍然是非常棘手的問題。耳道念珠菌自2009年出現(xiàn)以來，因其對人類的致死性（總死亡率40-60%），導(dǎo)致它逐漸成為一種超級真菌致病菌。耳道念珠菌，據(jù)報道令人難以置信的是對于更常見的合成抗真菌藥物，其耐藥性來自多藥耐藥（MDR）的比例占40%到≥2和4-10%。

傳統(tǒng)的中藥單體或植物化合物是篩選抗真菌藥物的一個很有前景的領(lǐng)域。THMS（Traditional herbal monomers，傳統(tǒng)草藥單體）中具有抗真菌活性的化學(xué)物質(zhì)包括苯丙類化合物、醌類化合物、黃酮類化合物 、萜類化合物、生物堿等，其中一些具有較強的抗真菌作用，最低抑菌濃度為≤32g/mL。與傳統(tǒng)的抗真菌藥物相比，大多數(shù)THMS對念珠菌的MDR發(fā)生率相對較低。為了能進一步提高THMS的抗真菌效果（特別是MIC32g/mL），聯(lián)合用藥是一種有效、抗真菌增殖策略。在中國，傳統(tǒng)藥物往往使用含有一種以上中藥單體的湯劑來治療細菌和/或真菌感染。

假設(shè)湯劑含有多個有效成分的湯的潛在作用方式與藥物組合有關(guān)。因此，研究THMs之間的聯(lián)合比與傳統(tǒng)合成抗真菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用對研究其抗真菌作用具有更重要意義。然而，體內(nèi)外藥物聯(lián)合的定義往往不一致，這可能是由于復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境（尤其是宿主免疫防御）對藥物抗真菌療效的影響（單獨或聯(lián)合）。

耳道念珠菌細胞壁由β-葡聚糖、甘露糖蛋白和少量的殼多糖(幾丁質(zhì))組成。耳道念珠菌的細胞壁蛋白參與白念珠菌的黏附和侵入。細胞壁是耳道念珠菌最外層結(jié)構(gòu)，完整的細胞壁呈剛性結(jié)構(gòu)，可以作為物理化學(xué)屏障保護細胞，并可以調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。耳道念珠菌感染時，是通過其細胞壁的主要組分與宿主細胞上相應(yīng)受體的相互作用介導(dǎo)對靶細胞的損傷。因此，研究針對細胞壁的抗耳道念珠菌藥物對于防治耳道念珠菌感染具有重要意義。

耳道念珠菌細胞壁作為第一個接觸點，是一個動態(tài)的、高度構(gòu)成的細胞器，也是最早感知和響應(yīng)由藥物攻擊引起的環(huán)境線索的部位。在大量的病原體分子模式(PAMP時)共價鏈接到細胞壁,β-1,3-glucan通常是被埋在外層由連接有N-/O-的甘露糖基化和磷酸化的甘露糖基化裝飾的糖基化的甘露糖蛋白下面 。當(dāng)感知外部刺激(如藥物攻擊)，內(nèi)部β-葡聚糖將會被暴露，這個過程叫做細胞壁重塑/重排(CWR)，隨后激活固有免疫防御。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種通過耳道念珠菌細胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種通過耳道念珠菌細胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法，包括下列步驟：