[發(fā)明專利]一種通過耳道念珠菌細胞壁重構來評價中藥單體抗真菌作用的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201911401864.3 | 申請日： | 2019-12-31 |
| 公開（公告）號： | CN111679069A | 公開（公告）日： | 2020-09-18 |
| 發(fā)明（設計）人： | 邵菁;劉娟娟;潘敏;陳夢麗;李倩倩;汪天明;吳大強;馬克龍;顏貴明;汪長中 | 申請（專利權）人： | 安徽中醫(yī)藥大學 |
| 主分類號： | G01N33/569 | 分類號： | G01N33/569;C12N1/14;C12R1/72 |
| 代理公司： | 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251 | 代理人： | 王華 |
| 地址： | 230000 *** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 通過 念珠菌 細胞壁 重構來 評價 中藥 單體 真菌 作用 方法 | ||
1.一種通過耳道念珠菌細胞壁重構來評價中藥單體抗真菌作用的方法，其特征在于：包括下列步驟：
步驟1：對保存的耳道念珠菌株進行活化培養(yǎng)培養(yǎng)12-16h，直至耳道念珠菌株達到指數生長階段，然后離心后收集真菌細胞，用PBS洗滌后，將耳道念珠菌株細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中復蘇，然后調節(jié)RPMI-1640培養(yǎng)基pH值為7.5，并將耳道念珠菌株細胞的濃度調節(jié)至1×103CFU/mL，得到評價菌液；
步驟2：將中藥單體加入至評價菌液，孵育12h后用無菌PBS洗滌一次，再用無菌PBS配制的質量分數為2% 的BSA封閉1小時，再然后用無菌PBS 洗滌一次；接下來加入100ul的β-葡聚糖抗體，放在4°C冰箱進行染色4h，染色結束后，用無菌PBS洗滌2次，再用cy3單抗鼠標記IgG在室溫下避光染色1小時，然后用無菌PBS避光洗滌3次后用1ml的無菌PBS進行避光重懸，避光震蕩混勻后用流式細胞儀進行葡聚糖熒光暴露強度的檢測；
步驟3：將100ul的濃度為100μg/mL的熒光染料Alexa Fluor 488 conjugated WGA、評價菌液和中藥單體混合，孵育12h，然后放到37°C搖床中進行避光搖晃15分鐘，然后用無菌PBS避光洗滌3次后用流式細胞儀進行幾丁質熒光暴露強度的檢測；
步驟4：用倒置熒光顯微鏡，選擇激發(fā)波長488nm和發(fā)射波長525nm，將菌液滴在粘附載玻片上，然后蓋上粘附蓋玻片在倒置熒光顯微鏡亮場和暗場下記錄β-葡聚糖與幾丁質熒光圖像；用含有抗體的無藥菌液做空白對照。
2.根據權利要求1所述的通過耳道念珠菌細胞壁重構來評價中藥單體抗真菌作用的方法，其特征在于：所述中藥單體的濃度為最低抑菌濃度。
3.根據權利要求1所述的通過耳道念珠菌細胞壁重構來評價中藥單體抗真菌作用的方法，其特征在于：用流式細胞儀BD Accuri C6的FL1通道，488nm激發(fā)波長和520 nm發(fā)射波長，耳道念珠菌細胞進樣5000個測幾丁質的熒光暴露強度。
4.根據權利要求1所述的通過耳道念珠菌細胞壁重構來評價中藥單體抗真菌作用的方法，其特征在于：用流式細胞儀BD Accuri C6的FL2通道，488nm激發(fā)波長和570 nm發(fā)射波長，耳道念珠菌細胞進樣5000個測β-葡聚糖的熒光暴露強度。
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