[發(fā)明專利]一種通過耳道念珠菌細(xì)胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911401864.3
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111679069A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵菁;劉娟娟;潘敏;陳夢麗;李倩倩;汪天明;吳大強;馬克龍;顏貴明;汪長中
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N1/14;C12R1/72
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

1.一種通過耳道念珠菌細(xì)胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法，其特征在于：包括下列步驟：

步驟1：對保存的耳道念珠菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)培養(yǎng)12-16h，直至耳道念珠菌株達(dá)到指數(shù)生長階段，然后離心后收集真菌細(xì)胞，用PBS洗滌后，將耳道念珠菌株細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中復(fù)蘇，然后調(diào)節(jié)RPMI-1640培養(yǎng)基pH值為7.5，并將耳道念珠菌株細(xì)胞的濃度調(diào)節(jié)至1×10³CFU/mL，得到評價菌液；

步驟2：將中藥單體加入至評價菌液，孵育12h后用無菌PBS洗滌一次，再用無菌PBS配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 的BSA封閉1小時，再然后用無菌PBS 洗滌一次；接下來加入100ul的β-葡聚糖抗體，放在4°C冰箱進(jìn)行染色4h，染色結(jié)束后，用無菌PBS洗滌2次，再用cy3單抗鼠標(biāo)記IgG在室溫下避光染色1小時，然后用無菌PBS避光洗滌3次后用1ml的無菌PBS進(jìn)行避光重懸，避光震蕩混勻后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行葡聚糖熒光暴露強度的檢測；

步驟3：將100ul的濃度為100μg/mL的熒光染料Alexa Fluor 488 conjugated WGA、評價菌液和中藥單體混合，孵育12h，然后放到37°C搖床中進(jìn)行避光搖晃15分鐘，然后用無菌PBS避光洗滌3次后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行幾丁質(zhì)熒光暴露強度的檢測；

步驟4：用倒置熒光顯微鏡，選擇激發(fā)波長488nm和發(fā)射波長525nm，將菌液滴在粘附載玻片上，然后蓋上粘附蓋玻片在倒置熒光顯微鏡亮場和暗場下記錄β-葡聚糖與幾丁質(zhì)熒光圖像；用含有抗體的無藥菌液做空白對照。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過耳道念珠菌細(xì)胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法，其特征在于：所述中藥單體的濃度為最低抑菌濃度。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過耳道念珠菌細(xì)胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法，其特征在于：用流式細(xì)胞儀BD Accuri C6的FL1通道，488nm激發(fā)波長和520 nm發(fā)射波長，耳道念珠菌細(xì)胞進(jìn)樣5000個測幾丁質(zhì)的熒光暴露強度。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過耳道念珠菌細(xì)胞壁重構(gòu)來評價中藥單體抗真菌作用的方法，其特征在于：用流式細(xì)胞儀BD Accuri C6的FL2通道，488nm激發(fā)波長和570 nm發(fā)射波長，耳道念珠菌細(xì)胞進(jìn)樣5000個測β-葡聚糖的熒光暴露強度。