[發(fā)明專利]一種基于磁珠法的一步法核酸提取工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911399484.0
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN110951725A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 董輝;金維榮;秦紅友;楊紅
• 申請（專利權(quán)）人: 申友基因組研究院（南京）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 朱欣欣

本發(fā)明涉及一種基于磁珠法的一步法核酸提取工藝，一種基于磁珠法的一步法核酸提取工藝，步驟如下：1)將1個試劑盒內(nèi)含有的6個深孔板分別進行預(yù)分裝處理，將經(jīng)過預(yù)分裝處理后的深孔板顛倒混勻、離心后，撕開深孔板的封膜，并在預(yù)分裝裂解結(jié)合液LB的深孔板孔中依次加入待測樣本和蛋白酶K；2)通過核酸提取儀進行核酸的提取；3)核酸提取程序完畢后，取出6個深孔板，第6板深孔板中的溶液即為核酸溶液；本發(fā)明將裂解液和結(jié)合液真正意義上統(tǒng)一，裂解和結(jié)合同時進行，大大提高了工作效率，提高了核酸提取的濃度，且保證了核酸純化的純度。整個試劑盒中不含任何有毒物質(zhì)，保證了操作人員的安全。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于磁珠法的一步法核酸提取工藝，屬于核酸分離純化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的核酸提取方法有酚-氯仿抽提法、堿抽提法、高鹽沉淀、離子交換法、磁珠法等。然而存在一些不足，如使用苯酚和氯仿等毒性試劑，抽提時間過長，提取的DNA濃度和純度低、半自動化、通量小等問題。高質(zhì)量的人類遺傳基因是各類研究的基礎(chǔ)，核酸技術(shù)直接影響下游實驗的實施。

針對目前磁珠類核酸提取試劑盒具有預(yù)處理繁瑣、核酸濃度低、純度低(多糖、無機鹽殘留等)、樣本單一性、通量小等問題，本公司發(fā)明了一種基于磁珠法的一步法核酸提取純化試劑盒。目前磁珠類核酸提取試劑盒預(yù)處理繁瑣，樣本需要先在裂解液的作用下充分裂解蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，再向裂解好的樣本中加入結(jié)合液去結(jié)合核酸，這樣的操作方式大大降低工作效率和增加實驗誤差。CN 109504678 A專利中雖然將裂解液和結(jié)合液統(tǒng)一，但是使用步驟仍然是先裂解細(xì)胞再去結(jié)合核酸，而且結(jié)合液中的異丙醇在高溫孵育過程中容易揮發(fā)，不能保證核酸濃度的穩(wěn)定性，且長期使用對操作人員造成身體傷害。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了基于磁珠法的一步法核酸提取試劑盒，本發(fā)明試劑盒的裂解液和結(jié)合液合并，裂解和結(jié)合同時進行，大大提高了工作效率；本試劑盒能滿足的樣本有唾液、全血、口拭子等的人類遺傳基因檢測樣本DNA提取及純化，且無需切換實驗程序，簡單操作。另外，本發(fā)明試劑盒預(yù)分裝在深孔板內(nèi)，一次性可以處理96個樣本，實現(xiàn)高通量的核酸自動化提取。

為了實現(xiàn)上述目的，技術(shù)方案是：研發(fā)一種基于磁珠法的一步法核酸提取純化試劑盒，其中包括預(yù)封裝試劑裂解結(jié)合液LB、洗液W1、洗液W2、洗液W3、洗脫液lowTE、磁珠混液和單管蛋白酶K，裂解結(jié)合液LB的組分是異硫氰酸胍2～5mol/L、SDS 0.5～1％(w/v)、Tris-HCl 20～50mmol/L、EDTA 5～10mmol/L、Nacl 20～50mmol/L、Triton X-100 0.2～1.5％(v/v)、Tween 20 0.2-1.0％(v/v)和PEG 400 5～30％(v/v)，溶劑是無菌水。洗液W1的組分是鹽酸胍2-4mol/L、Triton X-100 0.2～0.5％(v/v)、乙醇30～50％(v/v)，溶劑是無菌水。洗液W2是PEG 6000 5-10％(w/v)和Nacl 20～50mmol/L，溶劑是無菌水。洗液W3是75-80％(v/v)的乙醇。磁珠混液是磁珠0.25-2ng/ml和75-80％(v/v)的乙醇；洗脫液lowTE：Tris-HCl 10-30mmol/L、EDTA 1-5mmol/L。蛋白酶K濃度為20mg/mL。

異硫氰酸胍和SDS是變性劑，通過變性蛋白裂解細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多糖等。Tris-HCl溶液提供了保持核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的環(huán)境。EDTA作為核酸酶抑制劑，可以螯合溶液中Mg²⁺、Ca²⁺等二價金屬離子。Triton X-100和Tween 20是一種非離子型表面活性劑，其能夠溶解細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)，增加細(xì)胞膜的通透性，有助于核酸的釋放。PEG 400可以有效促進磁珠結(jié)合核酸，在加熱條件下PEG 400不會揮發(fā)。本發(fā)明裂解結(jié)合液，既能裂解細(xì)胞，又能為核酸與磁珠的結(jié)合提供合適的環(huán)境，減少了操作步驟和提高核酸提取的質(zhì)量。