[發明專利]一種胎盤間充質干細胞外泌體的制備和儲存方法

在審

• 申請號: 201911397112.4
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN111088226A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 趙藍;劉小翠;李靜靜;江嘉豪;孫燦興;何美第
• 申請（專利權）人: 廣東唯泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 許英偉

本發明涉及胎盤間充質干細胞外泌體的制備和儲存方法，屬于干細胞與再生醫學技術領域。該方法，包括以下步驟：將P3代胎盤間充質干細胞培養、待融合度達到80?90％后將其吸出培養基，更換DMEM培養基培養24h后收集上清液，去除細胞碎片，再通過0.22μm無菌過濾膜過濾，取濾液在13000r/min轉速下離心60min，上清液通過0.22μm無菌過濾膜過濾，即得到高純度外泌體，最后用生理鹽水重懸并13000r/min離心65min，獲得濃縮的外泌體；外泌體加入含SR無血清培養基、甘油和維生素C的凍存液，?80℃冰凍24h后取出，再放入?196℃液氮中凍存。上述胎盤間充質干細胞外泌體的制備方法，針對常規技術中的不足，通過調整提取方法和改良凍存液，取得高純度、高密度且能保持活性的外泌體。

技術領域

本發明涉及干細胞與再生醫學技術領域，特別是涉及一種胎盤間充質干細胞外泌體的制備和儲存方法。

背景技術

間充質干細胞(MSC)是一類來源于中胚層的具有高度更新和多向分化潛能的多能干細胞，可以在體外培養擴增并在特定的條件下分化為脂肪細胞、骨細胞、肝臟細胞等組織細胞。因此，間充質干細胞在臨床上被廣泛應用于細胞移植治療中。但是有研究表明，干細胞移植后的增值率很低，并不能代替整個組織，細胞移植治療的主要機制很可能為干細胞的外泌體促進組織修復而不是簡單的細胞代替。

外泌體是由活細胞分泌的直徑30-150nm、包含了復雜的RNA和蛋白質的雙層脂膜囊泡狀結構。間充質干細胞的外泌體內包含多種趨化因子、細胞因子以及生長因子的轉錄因子等，不僅可以招募血管內皮細胞、促進其增殖和遷移來促進血管再生，以改善宿主血供，進而促進組織損傷修復；還可以刺激宿主內源性細胞，激活其活性，從而改善組織環境、增強內源性修復系統。

胎盤屬于醫療廢棄物，是胎兒出生后排出母體的產后廢棄物，簡單易得。胎盤間充質干細胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)來源于胎盤絨毛膜。與其他來源的間充質干細胞相比，胎盤間充質干細胞的獲取簡單，且具有更強的增殖能力強，還能分泌更多的免疫調節因子。另外，間充質干細胞發揮作用的關鍵分子CD105在胎盤間充質干細胞中的含量更高。并且，胎盤間充質干細胞在體內向損傷組織遷移的能力更強，且具有更強的促進血管新生的能力。

由此，將胎盤來源的間充質干細胞進行分離、培養和純化，并進一步獲取其外泌體，能夠一定程度上提高干細胞臨床應用的成功率。然而，傳統的對胎盤間充質干細胞外泌體的分離提取方法中最常用的為超速離心法，采用低速、高速離心交替進行，但該手段比較費時、回收率不穩定、外泌體的純度受多種因素影響；另外，重復高速離心還可能對囊泡造成傷害，進而影響外泌體的純度。

發明內容

基于此，有必要針對上述問題，提供一種胎盤間充質干細胞外泌體的制備和儲存方法，

一種胎盤間充質干細胞外泌體的制備方法，包括以下步驟：

培養：將P3代胎盤間充質干細胞接種在干細胞培養基中培養、待融合度達到80-90％后將其吸出培養基，更換DMEM培養基培養24h，收集上清液，去除細胞碎片，得到包含外泌體的溶液；

純化：取上述包含外泌體的溶液，通過0.22μm無菌過濾膜過濾后取濾液，隨后將濾液置于10000-20000r/min轉速下離心50-90min，離心后取上清液通過0.22μm無菌過濾膜過濾，用生理鹽水重懸，并于10000-20000r/min離心50-90min，所得上清液即為外泌體。

上述胎盤間充質干細胞外泌體的制備方法，針對常規技術中提取時間長、提取純度不高的不足，通過調整提取方法，在較短時間內取得高純度、高密度的外泌體。

具體的，去除細胞碎片后的間充質干細胞在10000-20000r/min轉速下離心50-90min獲得高純度外泌體，再進一步離心純化濃縮，得到總蛋白濃度高的外泌體。