[發(fā)明專利]一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備和儲(chǔ)存方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911397112.4
• 申請(qǐng)日: 2019-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN111088226A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙藍(lán);劉小翠;李靜靜;江嘉豪;孫燦興;何美第
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東唯泰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 許英偉

1.一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

培養(yǎng)：將P3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞接種在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)、待融合度達(dá)到80-90％后將其吸出培養(yǎng)基，更換DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，收集上清液，去除細(xì)胞碎片，得到包含外泌體的溶液；

純化：取上述包含外泌體的溶液，通過0.22μm無菌過濾膜過濾后取濾液，隨后將濾液置于10000-20000r/min轉(zhuǎn)速下離心50-90min，離心后取上清液通過0.22μm無菌過濾膜過濾，用生理鹽水重懸，并于10000-20000r/min離心50-90min，所得上清液即為外泌體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，干細(xì)胞培養(yǎng)基包括：2％FBS，終濃度為40ng/mL的維生素C10ng/mL的bEGF。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備和儲(chǔ)存方法，其特征在于，將P3代細(xì)胞接種于干細(xì)胞培養(yǎng)基后，置于37℃、5％CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，上述去除細(xì)胞碎片的方法包括：第一次離心，以1800-5000r/min轉(zhuǎn)速離心25min，取上清液進(jìn)行第二次離心；第二次離心，以8000-10000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，保留上清液，即為包含外泌體的溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述P3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過以下方法獲得：

1)胎盤預(yù)處理：將采取得到的組織加入清洗液清洗至無血液殘留，離心保留沉淀，即獲得干凈的胎盤組織；

2)胎盤組織消化：將上述胎盤組織剪成小塊，并加入組織消化液消化，獲得分離的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；

3)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)：在上述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞中加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，即P0代培養(yǎng)，每隔3天半量換含青霉素和鏈霉素的完全培養(yǎng)液一次；

4)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：待原代培養(yǎng)至第15天、且細(xì)胞融合度達(dá)到80-90％時(shí)，完全棄掉培養(yǎng)液，清洗細(xì)胞并加入傳代培養(yǎng)消化液消化，消化結(jié)束后加入完全培養(yǎng)液終止消化，再分裝培養(yǎng)直至獲得P3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中的清洗液包括：生理鹽水，終濃度為10ug/mL的硫酸慶大霉素，10ug/mL的兩性霉素B和總體積的50％的紅細(xì)胞裂解液。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備和儲(chǔ)存方法，其特征在于，所述步驟2)中的組織消化液包括：含青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，50％Tryple酶和終濃度為0.6-0.7mg/mL的I型膠原酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中的傳代培養(yǎng)消化液包括：0.25％的胰蛋白酶和0.004％的EDTA。

9.一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的儲(chǔ)存方法，其特征在于，包括以下步驟：

取權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的制備方法制備得到的外泌體，向所述外泌體中加入等體積的凍存液，其中凍存液包括SR無血清培養(yǎng)基、甘油和維生素C，放入-80℃低溫冰箱冰凍24h，再取出放入-196℃液氮中凍存。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的儲(chǔ)存方法，其特征在于，所述凍存液包括：20％SR無血清培養(yǎng)基，25-30％甘油和15％維生素C。