[發明專利]一種脂肪體及其在評價待測蛋白與脂滴相互作用中的應用

有效

• 申請號: 201911393670.3
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN111057136B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 劉平生;馬學婧;支澤侖;周暢
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;G01N33/68;A61K47/24;A61K47/14
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發明公開了一種脂肪體及其在評價待測蛋白與脂滴相互作用中的應用。通過渦旋混合甘油三酯和磷脂，使用兩步法純化，制備出由甘油三酯核心和單層磷脂膜構成的脂肪體；磷脂為“DOPC和PI”、“DOPC和PA”、“DOPC和PS”、“DOPC、PI和DOPE”、“DOPC、PA和DOPE”或“DOPC、PS和DOPE”。同時發現脂肪體具體如下用途：檢測待測蛋白在脂滴上的結構、形態和/或密度，評價待測蛋白和脂滴相互作用，檢測待測蛋白和脂滴的親和力，檢測ATGL酶活性，分析待測蛋白中氨基酸殘基的位置和/或種類對待測蛋白在脂滴的定位的影響，分析磷脂組分對待測蛋白在脂滴的定位的影響。本發明具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種脂肪體及其在評價待測蛋白與脂滴相互作用中的應用。

背景技術

脂滴是單層磷脂膜包裹中性脂核心、表面被覆蛋白的多功能細胞器，它參與脂質的合成、儲存、代謝和轉運，蛋白的儲存和降解，脂質信號分子和激素的修飾和合成，并與其它細胞器發生動態相互作用。脂滴的蛋白和脂質組分的改變均可能導致脂滴功能的異常，進而引起人類代謝疾病的發生。因此，脂滴生物學的研究重要性日益凸顯。

借助蛋白質組學和脂質組學的技術手段，不同物種的脂滴的蛋白質和脂質組成日益清晰。但是，由于體內研究系統復雜，脂滴與其它細胞器有相互作用，蛋白的敲除或過表達可能引起其他蛋白的補償作用，并且無法精確改變脂滴的脂質組分，因此，為了全面地理解脂滴的形成、功能和調控機制，構建了人工脂滴。

脂肪細胞分化相關蛋白(ADRP)是主要的脂滴常駐蛋白之一。然而，調控ADRP脂滴定位的機制還不明確。脂滴中，甘油三酯是中性脂核心的主要組成部分。甘油三酯通過脂肪水解酶ATGL分解為脂肪酸，脂肪酸被用作細胞能量和物質合成原料。ATGL活性降低會引起各個組織脂肪過度積累而導致代謝疾病的發生。磷酸化是調控脂類水解酶活性的機制之一。人們已經發現了ATGL的八個磷酸化位點，其中Ser406 S396調控其活性，Thr372調控其定位。但是，其它磷酸化位點在脂滴定位和活性調控中發揮怎樣的作用，哪些蛋白和脂質參與了ATGL的調控仍不清楚。因此，ATGL的活性和細胞定位的調控機制有待進一步研究。由于體內研究系統復雜，蛋白的敲除或過表達可能引起其它蛋白的補償作用，無法研究磷酸化這一單一因素對ATGL活性的影響。

發明內容

本發明的目的是制備一種新的脂肪體，并研究脂肪體的應用。

本發明首先保護一種制備脂肪體的方法，可包括步驟：a1)將磷脂和甘油三酯在緩沖液中進行渦旋以實現兩者的反應，然后進行離心，收集上層液相，從上層液相中分離得到脂肪體；磷脂和甘油三酯的質量比可為d1)至d6)中的任一種：d1)0.25～3:5；d2)3:5；d3)2:5；d4)1:5；d5)1:10；d6)1:20；

所述磷脂為B1)、B2)、B3)、B4)、B5)、B6)或B7)：B1)DOPC和PI；B2)DOPC和PA；B3)DOPC和PS；B4)DOPC、PI和DOPE；B5)DOPC、PA和DOPE；B6)DOPC、PS和DOPE；B7)DOPC和膽固醇。

所述“從上層液相中分離得到脂肪體”可包括如下步驟：

a2)將所述上層液相進行兩次以上的純化；每次純化的方法可為：將上層液相與所述緩沖液混勻，然后使其分層，收集上層液相；

a3)將步驟a2)得到的上層液相與所述緩沖液混合，然后使其分層，收集下層液相，其中含有脂肪體。

所述緩沖液可為緩沖液B。

所述緩沖液B的溶質及其在緩沖液中濃度可為：15mM～25mM HEPES，80mM～120mMKCl，1.5～2.5mM的MgCl₂；溶劑可為去離子水；pH可為7.2～7.6。