[發(fā)明專利]間充質(zhì)干細(xì)胞來源囊泡包裹三氧化二砷的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911392308.4
• 申請(qǐng)日: 2019-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN113116927A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張曉輝;劉曉;蘇艷;黃曉軍;黃波;劉玉英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)人民醫(yī)院（北京大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院）
• 主分類號(hào): A61K35/28
• 分類號(hào): A61K35/28;A61P37/06;A61K33/36
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 王灝增

本發(fā)明涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞來源囊泡包裹三氧化二砷的制備方法，包括：1)將間充質(zhì)干細(xì)胞置于含有三氧化二砷的培養(yǎng)基中，先進(jìn)行紫外照射處理，后進(jìn)行培養(yǎng)，使間充質(zhì)干細(xì)胞釋放囊泡，2)提取培養(yǎng)物中的囊泡，得到間充質(zhì)干細(xì)胞來源的囊泡包裹的三氧化二砷。本發(fā)明結(jié)合紫外線照射和藥物處理的方式，將ATO包入MSC?EVs中，制備成復(fù)合制劑，以期同時(shí)發(fā)揮ATO和MSC?EVs的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)GVHD進(jìn)行干預(yù)，為臨床治療提供新方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用間充質(zhì)干細(xì)胞來源囊泡(MSC-EVs)包裹三氧化二砷(ATO)制備復(fù)合制劑的方法。

背景技術(shù)

急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)是異基因造血干細(xì)胞移植(allo-geneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后一種重要的并發(fā)癥，是移植后導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。糖皮質(zhì)激素是目前公認(rèn)的aGVHD一線治療藥物，但激素治療維持長(zhǎng)期緩解的患者不足50％，激素耐藥aGVHD死亡率達(dá)70％以上。因此，激素耐藥aGVHD成為造血干細(xì)胞移植后合并癥的研究熱點(diǎn)。近年來，MSC治療激素耐藥aGVHD有許多進(jìn)展，其通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群增殖分化，阻斷DC向T細(xì)胞提呈抗原、干擾NK細(xì)胞功能、以及歸巢至損傷部位、促進(jìn)組織修復(fù)等減輕aGVHD。

細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由細(xì)胞經(jīng)旁分泌方式產(chǎn)生的納米級(jí)微顆粒，主要包括外泌體、膜微粒和凋亡小體3種組分，其分子大小和產(chǎn)生方式略有差異。EVs存在于廣泛微環(huán)境，包括血液、唾液、精液、尿液、乳汁等，幾乎所有細(xì)胞均可自發(fā)或經(jīng)刺激后產(chǎn)生EVs，如MSC能在低氧環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生EVs。EVs攜帶眾多細(xì)胞內(nèi)信息物質(zhì)(如細(xì)胞生長(zhǎng)因子、mRNA、miRNA、DNA、脂質(zhì)等)從而能參與物質(zhì)交換、信息傳遞等功能。在臨床應(yīng)用中，EVs既能作為藥物本身，也能作為藥物載體發(fā)揮作用。MSC來源細(xì)胞外囊泡(MSC derivedEVs,MSC-EVs)相較于MSC，有諸多優(yōu)勢(shì)：首先，MSC-EVs為非細(xì)胞，無致腫瘤、致突變等安全性問題；其次，MSC-EVs定向?qū)⒛讣?xì)胞信息向特定靶細(xì)胞傳遞，同時(shí)其磷脂雙分子層保護(hù)所包含的物質(zhì)在信息傳遞過程中不受降解；最后，MSC-EVs容易制備，適合量產(chǎn)，便于運(yùn)輸。上述優(yōu)勢(shì)均為MSC-EVs在臨床上廣泛應(yīng)用提供了可能。

三氧化二砷(ATO)ATO作為砒霜的主要成分之一，是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的藥物。近年來，ATO逐漸被發(fā)現(xiàn)在自身免疫病中有一定治療作用；因?yàn)锳TO既能發(fā)揮促炎作用，也能發(fā)揮抗炎作用，在不同環(huán)境調(diào)節(jié)免疫平衡。Singer M等鼠模型驗(yàn)證ATO可通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，減輕結(jié)腸炎炎性反應(yīng)；Bobe Pdeng研究表明ATO通過促進(jìn)活化的T淋巴細(xì)胞凋亡治療小鼠SLE；研究發(fā)現(xiàn)，ATO也促進(jìn)CD4+T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等凋亡，促進(jìn)Treg細(xì)胞產(chǎn)生，影響單核細(xì)胞和B細(xì)胞分化過程。Kavian N等采用ATO殺傷CD4+T細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)，緩解鼠模型慢性GVHD(Chronic GVHD，cGVHD)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種利用MSC-EVs包裹ATO制備復(fù)合制劑的方法，用于干預(yù)GVHD，為其治療提供新方法，提高ATO治療GVHD的治療效果。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源囊泡包裹三氧化二砷(MSC-ATO-EVs)的制備方法，包括如下步驟：

1)分離、傳代培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell,MSC)；

2)加入三氧化二砷(Arsenictrioxide,ATO)處理MSC，同時(shí)紫外線照射，使MSC釋放囊泡(Extracellular vesicles,EVs)；

3)采用多次離心方法提取包括有ATO的MSC囊泡，即得到MSC-ATO-EVs。

上述方法中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源囊泡包裹三氧化二砷(MSC-ATO-EVs)為一種復(fù)合制劑。