[發明專利]將CRISPR-Cas9系統導入人干細胞的方法

在審

• 申請號: 201911391005.0
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN110951785A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 姜舒;張蕓;熊斌
• 申請（專利權）人: 深圳三智醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N9/22
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 劉曉燕

本發明涉及一種將CRISPR?Cas9基因編輯系統高效導入人干細胞的方法，包括以下步驟：(1)構建獲得HBB?sgRNA?Cas9?T2A?GFP?SZ重組質粒；(2)采用Neon系統將HBB?sgRNA?Cas9?T2A?GFP?SZ重組質粒導入人干細胞中；所述電穿孔轉染的條件為：當人干細胞為人間充質干細胞時：脈沖電壓1300?1700V，脈沖時程小于30ms，脈沖次數至少一次；當人干細胞為人造血干細胞時為：脈沖電壓1450?1550V、脈沖寬度40ms，脈沖數至少一次；(3)細胞培養。本發明利用電穿孔法將CRIPSR?Cas9基因編輯系統轉入干細胞，能有效提高電穿孔轉染后干細胞的存活率。

技術領域

本發明涉及基因編輯技術，特別涉及一種將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法。

背景技術

干細胞是現代生物醫藥技術研究領域的重要原材料，也是目前基因治療領域中重要的靶細胞。在以干細胞為靶細胞的基因治療中，將基因編輯系統轉入干細胞的同時還需維持其具有的分化特性以及細胞活性等，因此所面臨的挑戰遠高于對其它細胞的轉染。目前，利用高效的CRISPR-Cas9基因編輯系統對干細胞進行基因修飾是基因治療的重要手段，將外源基因轉入譜系特異的干細胞，并能夠使其整合進染色體或作為附加基因隨細胞分裂維持高水平和持久的表達是基因編輯成功的關鍵點。

基于目前各研究報道，電穿孔轉染法是除病毒載體及脂質體外針對干細胞最高效的基因轉移手段，其原理是在電場作用下，細胞膜上形成小孔或開口，質粒能在電擊產生的電場力作用下與細胞膜接觸，并與細胞膜上電穿孔的區域形成可轉移的復合物，隨后質粒脫離復合物擴散至細胞質，部分質粒轉移至細胞核內與染色體整合。電穿孔轉染法是一種簡便的基因轉移方法，具有其他方法無法比擬的優越性，如操作簡便、快捷，可重復性強、轉染率高、適用細胞種類廣譜等等。

鑒于CRISPR-Cas基因編輯系統轉入干細胞進行基因治療的臨床轉化應用，電穿孔轉染法對于干細胞的基因導入具有更好的安全性和更高的轉染效率，是現有轉染方法中的最佳選擇，然而電場作用會對細胞造成直接損傷，因此如何提高電穿孔轉染后干細胞的存活率是亟待解決的重要問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種采用電穿孔轉染法將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，可提高電穿孔轉染后干細胞的存活率。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，包括以下步驟：

(1)化學合成CRISPR-Cas9表達框并連接GFP表達基因，構建獲得Cas9-T2A-GFP-SZ骨架質粒；針對HBB基因設計靶向的HBB-sgRNA，所述HBB-sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；然后將HBB-sgRNA與Cas-T2A-GFP-SZ骨架質粒連接，獲得HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重組質粒；

(2)采用Neon系統，利用電穿孔轉染法將HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重組質粒導入人干細胞中；所述電穿孔轉染的條件為：當人干細胞為人間充質干細胞時，電穿孔轉染條件為：脈沖電壓1300-1700V，脈沖時程小于30ms，脈沖次數至少一次；當人干細胞為人造血干細胞時，電穿孔轉染條件為：脈沖電壓1450-1550V、脈沖寬度40ms，脈沖數至少一次；

(3)將電穿孔完成后的樣品進行細胞培養。

本發明的有益效果在于：