[發明專利]將CRISPR-Cas9系統導入人干細胞的方法

在審

• 申請號: 201911391005.0
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN110951785A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 姜舒;張蕓;熊斌
• 申請（專利權）人: 深圳三智醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N9/22
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 劉曉燕

1.一種將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)化學合成CRISPR-Cas9表達框并連接GFP表達基因，構建獲得Cas9-T2A-GFP-SZ骨架質粒；針對HBB基因設計靶向的HBB-sgRNA，所述HBB-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；然后將HBB-sgRNA與Cas-T2A-GFP-SZ骨架質粒連接，獲得HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重組質粒；

(2)采用Neon系統，利用電穿孔轉染法將HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重組質粒導入人干細胞中；所述電穿孔轉染的條件為：當人干細胞為人間充質干細胞時，電穿孔轉染條件為：脈沖電壓1300-1700V，脈沖時程小于30ms，脈沖次數至少一次；當人干細胞為人造血干細胞時，電穿孔轉染條件為：脈沖電壓1450-1550V、脈沖寬度40ms，脈沖數至少一次；

(3)將電穿孔完成后的樣品進行細胞培養。

2.根據權利要求1所述的將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述人干細胞為間充質干細胞，所述電穿孔轉染的條件為：脈沖電壓為1300V至1400V范圍內。

3.根據權利要求2所述的將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，所述電穿孔轉染的條件為：脈沖電壓為1325V，脈沖時程為20ms，脈沖次數為2次。

4.根據權利要求1所述的將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用10μL規格的Tip槍頭進行電穿孔轉染操作。

5.根據權利要求1-3任意一項所述的將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重組質粒的A260/280比值不低于1.64，濃度不低于508ng/μL。

6.根據權利要求2-3任意一項所述的將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重組質粒的A260/280比值不低于1.8，濃度不低于1μg/μL。

7.根據權利要求1所述的將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，步驟(1)與步驟(2)之間還包括驗證HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ的基因編輯效果的步驟。

8.根據權利要求1所述的將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述人干細胞為造血干細胞，所述電穿孔轉染的條件為：脈沖電壓為1500V，脈沖寬度為40ms，脈沖次數為1次。

9.根據權利要求8所述的將CRISPR-Cas9基因編輯系統導入人干細胞的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重組質粒的A260/280比值不低于1.8，濃度不低于1μg/μL。