[發(fā)明專利]一種培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911389986.5
• 申請(qǐng)日: 2019-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN110938596A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈在美;黃玉香;王芮;劉超;姜磊;李文菁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島奧克生物開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 呂紀(jì)濤

本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法，屬于腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域，將來源于腹腔液的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)得到免疫細(xì)胞；所述免疫細(xì)胞包括NK細(xì)胞和/或CIK細(xì)胞。采用本發(fā)明提供的方法培養(yǎng)得到免疫細(xì)胞，不僅利用了病理廢棄物腹腔液，而且減少了利用外周血培養(yǎng)免疫細(xì)胞給患者造成的二次刺激。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

目前NK和CIK前體細(xì)胞主要來源于人外周血分離的單個(gè)核細(xì)胞，對(duì)于腫瘤患者經(jīng)過放化療后，外周血淋巴細(xì)胞核DNA及細(xì)胞免疫功能都會(huì)有一定程度的損傷，此時(shí)，采取患者外周血是對(duì)患者的二次刺激。大多數(shù)腫瘤患者后期會(huì)產(chǎn)生腹腔液，臨床上一般會(huì)采取放腹水的方式減輕腫瘤患者的病癥。

目前現(xiàn)有腹水的用途主要有以下幾個(gè)方面：(1)利用臨床細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)腹水，鑒別腹水性質(zhì)，從而診斷癌癥。(2)從腹水中分離鑒定exosomes是腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。(3)從腫瘤患者腹腔液中分離癌細(xì)胞，為免疫細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。(4)從卵巢腫瘤患者中分離具有免疫活性的DC(樹突狀細(xì)胞)前體細(xì)胞。(5)回收胸腹水中有效成分，制備自體蛋白和TIL(腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)，其中自體蛋白通過靜脈回輸為患者提供營(yíng)養(yǎng)支持，同時(shí)可改變腹體滲透壓從而抑制腹水的產(chǎn)生，TIL在N-IL-2誘導(dǎo)下，成為L(zhǎng)AK(淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。目前未有分離腹水中單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)而培養(yǎng)成NK和CIK細(xì)胞進(jìn)行腫瘤免疫細(xì)胞治療的方案。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法，采用本發(fā)明提供的方法培養(yǎng)得到免疫細(xì)胞，不僅利用了病理廢棄物腹腔液，而且減少了利用外周血培養(yǎng)免疫細(xì)胞給患者造成的二次刺激。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法，將來源于腹腔液的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)得到免疫細(xì)胞；

所述免疫細(xì)胞包括NK細(xì)胞和/或CIK細(xì)胞。

優(yōu)選的，當(dāng)所述免疫細(xì)胞為NK細(xì)胞時(shí)，將上述技術(shù)方案所述的單個(gè)核細(xì)胞與NK細(xì)胞培養(yǎng)液、質(zhì)量百分含量為8～12％的胎牛血清溶液、飼養(yǎng)細(xì)胞混合后，得到混合物，將所述混合物培養(yǎng)14d，得到NK細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)量與NK細(xì)胞培養(yǎng)液的體積、質(zhì)量百分含量為8～12％的胎牛血清溶液的體積、飼養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量比為2.5～3.5×10⁷cells:16～23ml:1.6～2.3ml:1.8～2.2×10⁷cells。

優(yōu)選的，所述混合物接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，所述單個(gè)核細(xì)胞的接種密度為0.5～1.5×10⁶cells/ml。

優(yōu)選的，當(dāng)使用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)第4d時(shí)，更換培養(yǎng)瓶，所述單個(gè)核細(xì)胞的接種密度為1.2～1.8×10⁶cells/ml，第4d至第6d維持細(xì)胞密度為1.2～1.8×10⁶cells/ml。

優(yōu)選的，第7d時(shí)，往培養(yǎng)瓶中添加飼養(yǎng)細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞的添加量為7.2～8.8×10⁷cells/瓶。

優(yōu)選的，當(dāng)所述免疫細(xì)胞為CIK細(xì)胞時(shí)，將權(quán)利要求1所述的單個(gè)核細(xì)胞與CIK培養(yǎng)液混合后，將得到的混合物在37℃、5％CO₂下進(jìn)行培養(yǎng)13d，得到CIK細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述混合物接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)瓶的規(guī)格為175cm²。

優(yōu)選的，培養(yǎng)24h后，向培養(yǎng)瓶中添加CD3McAb、IL-2和IL-1α，使CD3McAb的終濃度為90～110ng/ml，IL-2的終濃度為900～1100U/ml，IL-1α的終濃度為900～1100U/ml。