[發明專利]一種人凝血因子IX的制備方法

有效

• 申請號: 201911387911.3
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN111378029B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 黃亮;楊德軍;李興旺;王強;蔣德席
• 申請（專利權）人: 四川遠大蜀陽藥業有限責任公司
• 主分類號: C07K14/745
• 分類號: C07K14/745;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

為了解決現有人凝血因子IX產品的不穩定問題，本發明提供了一種人凝血因子IX的制備方法，屬于生物制品領域。本發明公開方法包括如下步驟：(1)血漿去除冷沉淀；(2)陰離子交換層析純化；(3)病毒滅活；(4)陰離子交換層析純化；(5)肝素親和層析純化；(6)疏水層析純化；(7)經超濾、深層過濾，或者深層過濾、超濾；以及除菌、除病毒和凍干步驟。本發明還提供了所述方法制備得到的產品，包括凝血因子IX原液和凍干品。本發明的工藝由于能制備人凝血因子IX原液，可以支持人凝血因子IX原液配制前的中間品凍存后合批，大大降低了凍干的能耗、減少了操作人員的工作量。

技術領域

本發明涉及生物制品領域，特別涉及一種人凝血因子IX的制備方法及其制劑。

背景技術

乙型血友病的早期治療方案為輸注新鮮血漿或新鮮冰凍血漿。需輸注的劑量大且有高血容量的危險，心臟負荷過重，副作用較大，且病毒感染的風險大，因而血漿不是治療的理想藥劑。為減少這些副作用，20世紀50年代末開始開發人凝血因子IX制劑。由于人凝血因子IX在血漿中含量少，不穩定、易分解，且FII、FVII、人凝血因子IX、FX具有相似的理化性質等，因而純化人凝血因子IX的難度較大。早期的人凝血因子IX制劑均為人凝血因子IX的濃縮物，即凝血酶原復合物(PCC)。這類制劑的人凝血因子IX比活性一般在0.7～1.0IU/mg，除含人凝血因子IX外還含有其他維生素K依賴因子II、VII、X和蛋白C、蛋白S等雜蛋白。大劑量反復使用此類制劑將激活FVIIa、人凝血因子IXa、FXa和過量的FII、FX及磷脂，有引起廣泛性靜脈血栓的可能或產生彌散性血管內凝血的危險，因此一般輸注該藥時需在醫院注射，需留院觀察以防止意外發生。而且由于溶血性的影響，該藥復溶后的濃度低，一般只有20IU/ml，臨床用藥輸注時間通常都在1小時以上。為降低凝血酶原復合物的副作用，隨著蛋白分離純化技術的提高，20世紀90年代開始研制生產高純的人凝血因子IX制劑，這類制劑去除了FII、FVII、FX等雜蛋白，人凝血因子IX比活性一般在50～200IU/mg。可避免由于其他凝血因子活化誘發的血栓類副反應，致血栓副作用明顯減少，是迄今治療乙型血友病的最佳選擇。

人凝血因子IX在分離純化過程中，存在蛋白結構不穩定易析出的問題。

為了解決這個問題，國外的部分上市產品，比如Grifols生產的AlphaNine?貝賦的重組產品Ben人凝血因子IX、Biotest的通常會配備過濾裝置，以除去產品復溶后可能產生的蛋白析出物。此舉使得人凝血因子IX產品使用較為不便；且經過濾后的溶液，其人凝血因子IX的效價會降低。

使用保護劑也是一種解決該問題的方法。比如CLS生產的BerininMono人凝血因子IX-kedrion生產的Aima人凝血因子產品，中國專利CN?105175486?A公開的人凝血因子IX試制品，都添加了比如肝素鈉、AT-III保護劑中的一種或兩種。而肝素鈉的加入可能給人凝血因子IX產品帶入肝素鈉過敏風險，增加出血風險；AT-III則可能使人出現口干、視力模糊、頭昏、面紅、心悸、疲乏甚至精神失常等癥狀。

同樣因為人凝血因子IX蛋白結構不穩定易析出的原因，傳統人凝血因子IX制備工藝通常只允許血漿吸附后產生的中間品冰凍保存，而不能將配制前的人凝血因子IX中間品凍存后合批以制備原液，同時由于層析柱純化規模的限制，通常會導致每批次凍干的產品數量少，凍干批次多，生產成本高。

發明內容

為了解決現有產品容易析出的問題，以及因此引發的一系列次生問題，本發明提供了一種人凝血因子IX的制備方法及其制劑。

本發明首先提供了一種人凝血因子IX原液的制備方法，包括如下步驟：

(1)血漿去除冷沉淀；

(2)陰離子交換層析純化：使用凝膠吸附如步驟(1)得到的去冷沉淀血漿，洗滌緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫收集凝血因子IX粗提液；

(3)病毒滅活；