[發明專利]一種人凝血因子IX的制備方法

有效

• 申請號: 201911387911.3
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN111378029B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 黃亮;楊德軍;李興旺;王強;蔣德席
• 申請（專利權）人: 四川遠大蜀陽藥業有限責任公司
• 主分類號: C07K14/745
• 分類號: C07K14/745;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種人凝血因子IX原液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)血漿去除冷沉淀；

(2)陰離子交換層析純化：使用DEAE?Sepharose?A50凝膠吸附如步驟(1)得到的去冷沉淀血漿，洗滌緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫收集凝血因子IX粗提液；

(3)病毒滅活；

(4)陰離子交換層析純化：用水稀釋病毒滅活后溶液，上樣，平衡緩沖液沖洗層析柱，洗滌緩沖液洗滌層析柱，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液；所述層析柱為FractogelEMD?DMAE、DEAE?Sepharose?FF、DEAE-Toyopearl?650M、Q-Sepharose?FF、Capto?DEA、ToyopearlDEAE、Fractogel?EMD?Amino650M或TOYOPEARL?Amino-650M；

(5)肝素親和層析純化：稀釋或超濾透析步驟(4)的洗脫液，使其氯化鈉濃度低于本步驟洗滌緩沖液氯化鈉濃度，上樣，平衡緩沖液沖洗層析柱，洗滌緩沖液洗滌層析柱，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液；所述層析柱為Heparin?Sepharose?6FF、Heparin?Sepharose?CL6B、Capto?Heparin或AF-Heparin?HC-650M；

?(6)疏水層析純化：加電導調節液，上樣，平衡緩沖液沖洗層析柱，合并收集流穿和沖洗液；所述層析柱為Toyopearl?Phenyl?650M、Octyl?Sepharose?CL-4B或Toyopearl?PPG-600M；

?(7)經超濾、深層過濾，或者深層過濾、超濾，即得。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：

步驟(2)所述洗滌緩沖液包含0.01-0.25M枸櫞酸鹽或磷酸鹽、0.15-0.25M氯化鈉，pH為6.5～7.5；

和/或，步驟(2)所述洗脫緩沖液包含0.01-0.25M枸櫞酸鹽或磷酸鹽、0.3-1.5M氯化鈉，pH為6.5～7.5；

和/或，步驟(4)所述平衡緩沖液包含0.01-0.03M枸櫞酸鹽、0.15-0.35M氯化鈉，pH6.0～7.5；

和/或，步驟(4)所述洗滌緩沖液包含0.01-0.03M枸櫞酸鹽、0.25-0.40M氯化鈉，pH為6.0～7.5；

和/或，步驟(4)所述洗脫緩沖液包含0.01-0.03M枸櫞酸鹽、0.35-0.60M氯化鈉，pH為6.5～8.0；

和/或，步驟(5)所述平衡緩沖液包含0.01-0.03M枸櫞酸鹽，pH為7.0～7.5；

和/或，步驟(5)所述洗滌緩沖液包含0.01-0.03M枸櫞酸鹽、0.20-0.35M氯化鈉，pH為7.0～7.5；

和/或，步驟(5)所述洗脫緩沖液包含0.01-0.03M枸櫞酸鹽、0.45～1M氯化鈉、2～7g/L鹽酸精氨酸、0.5～3g/L鹽酸賴氨酸，pH為7.0～7.5的混合溶液；

和/或，步驟(6)所述電導調節液包含0.01-0.03M枸櫞酸鹽、2.0-2.8M氯化鈉、2～7g/L鹽酸精氨酸、0.5～3g/L鹽酸賴氨酸，pH為7.0～7.5；

和/或，步驟(6)所述平衡緩沖液包含0.01-0.03M枸櫞酸鹽、1.5M氯化鈉、2～7g/L鹽酸精氨酸、0.5～3g/L鹽酸賴氨酸，pH為7.0～7.5；

和/或，步驟(7)所述深層過濾使用的是普通濾板；所述超濾的截留分子量為10～30KD。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：

步驟(4)和/或步驟(5)所述洗脫緩沖液含有0.5M氯化鈉；

和/或，步驟(6)的電導調節液含有2.5M氯化鈉；

和/或，步驟(6)的平衡緩沖液含有1.5M氯化鈉；

和/或，步驟(6)所述電導調節液的添加量與步驟(5)洗脫液體積相同；

和/或，步驟(7)所述的深層過濾是采用含有硅藻土或珍珠巖助濾劑的濾板過濾。

4.一種人凝血因子IX原液的制備方法，其特征在于，其是將權利要求1-3任一所述方法的步驟(3)和步驟(4)交換順序得到的制備方法。