[發(fā)明專利]一種高靈敏度融合基因檢測方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911385095.2
• 申請日: 2019-12-28
• 公開（公告）號: CN110820051B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊學(xué)敏;陳永順;張燕菲;高豐鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州表觀生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/686
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

本發(fā)明提供了一種高靈敏度融合基因檢測方法及其應(yīng)用。相比于現(xiàn)有報道，本發(fā)明使用SMART技術(shù)，微量建庫，同時獲得高保真、高豐度的mRNA信息；使用的錨定多重PCR聯(lián)合高通量測序檢測方法，無需知曉與已知基因發(fā)生融合的基因，無需知曉融合方式，也可獲得高準(zhǔn)確率、高可信度、全面的發(fā)生融合基因的信息、轉(zhuǎn)錄組上的位點，這是現(xiàn)有的技術(shù)：RT?PCR、IHC和FISH，都無法達(dá)到的。

本申請要求了2018年12月28日提交中國專利局的，申請?zhí)枮?01811621317.1，發(fā)明名稱為“一種高靈敏度外泌體融合基因檢測方法及其應(yīng)用”的中國專利申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在本申請中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高通量測序及文庫構(gòu)建領(lǐng)域，更具體地，涉及一種高靈敏度融合基因檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

融合基因已經(jīng)作為診斷腫瘤、檢測腫瘤發(fā)展的分子標(biāo)記以及治療腫瘤的靶標(biāo)，例如BCR-ABL融合基因上個世紀(jì)六十年代就被用于輔助診斷慢性粒細(xì)胞白血病，針對BCR-ABL融合的抑制劑Imatinib

(格列衛(wèi))是目前療效良好的治療慢性粒細(xì)胞白血病的靶向藥物。又如針對融合基因EML4-ALK的靶向抑制藥物Crizotinib成為臨床治療非小細(xì)胞肺癌的一線藥物。2018年11月底美國FDA批準(zhǔn)上市一款精準(zhǔn)抗癌藥———Vitrakvi，這是有史以來第一款TRK抑制藥物，用于治療攜帶NTRK基因融合的實體腫瘤病人，這是第一款與瘤種無關(guān)的“廣譜”抗癌藥，針對17種腫瘤治療有75％的治療有效率。

目前融合基因的檢測，樣本主要為瘤組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或從全血中提取的mRNA。使用的檢測方法主要有逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、免疫組化化學(xué)方法(IHC)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)等方法。

RT-PCR存在以下局限性：1)必須知曉發(fā)生融合的兩個基因的序列；2)必須知曉兩基因發(fā)生融合的方式；3)不能或難以同時檢測不同基因與一個已知基因的融合。利用該方法必須根據(jù)不同融合方式設(shè)計不同的引物來進(jìn)行檢測，且不能檢測出未知的另一個融合基因以及未知的融合方式，這將直接導(dǎo)致融合基因檢測困難及檢出率的降低。

FISH法存在以下局限性：1)FISH操作方法復(fù)雜、耗時長；2)不能夠確認(rèn)參與融合的基因，也不能夠區(qū)分不同的融合類型，可能會錯失發(fā)生率低或者較為復(fù)雜的重排形式的融合基因；3)常規(guī)FISH方法需要計算不少于50個細(xì)胞，所以對于組織量少的標(biāo)本(例如穿刺活檢樣本)，F(xiàn)ISH不能操作；4)必須知曉發(fā)生融合的兩個基因的序列來設(shè)計探針；5)兩個發(fā)生融合的基因所在染色體的位置必須相距較近；6)不能同時檢測不同基因與一個已知基因的融合。因此該方法須針對融合的兩個基因的不同，設(shè)計不同的探針，且不能檢測出未知的融合基因，這將影響到融合基因的檢測率。

IHC法的局限性：1)結(jié)果是由人眼辨別切片的著色強(qiáng)度，并通過計分制判定結(jié)果，其中存在人為因素干擾，某些情況下，需要聯(lián)合IHC和FISH兩種方法做出判定結(jié)果；2)免疫組化利用的是抗原抗體特異性的原理，所以需要檢測融合蛋白，并且需要針對該融合蛋白的特異性抗體，費(fèi)用高，且可檢測的蛋白極為有限。

腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中會連續(xù)不斷地將外泌體釋放到細(xì)胞微環(huán)境中，進(jìn)一步進(jìn)入體液循環(huán)中。目前，在許多體液中都可檢測到外泌體的存在，如血液、惡性腫瘤形成的腹腔積液、尿液、羊水、乳汁和唾液等，這些臨床樣本收集方法簡便，提高了使用外泌體作為臨床檢測的可行性。外泌體中含有來源于分泌細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)、信使RNA(mRNA)、小RNA(micoRNA)、DNA片段等信號分子，這些信號分子能夠提供源細(xì)胞的相關(guān)信息，甚至包含細(xì)胞病變相關(guān)的特征信息，可以實時監(jiān)測腫瘤細(xì)胞生理機(jī)能的變化，并且來源于腫瘤細(xì)胞的外泌體中的信號分子含量高于正常細(xì)胞。已有文章表明，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中可以檢測到腫瘤細(xì)胞來源的mRNA，并且外泌體中的mRNA可以反映腫瘤細(xì)胞mRNA的基因融合情況等生物學(xué)特性。Nilsson等分析11例前列腺癌患者尿液中外泌體的成分，發(fā)現(xiàn)外泌體融合基因TMPRSS2-ERG的表達(dá)高低與Gleason評分高低基本一致。