[發(fā)明專利]一種高靈敏度融合基因檢測(cè)方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911385095.2
• 申請(qǐng)日: 2019-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN110820051B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊學(xué)敏;陳永順;張燕菲;高豐鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州表觀生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C12Q1/686
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

1.一種高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1)獲取樣品中的總RNA，在含Mg²⁺的第一緩沖體系中，在90-105℃條件下反應(yīng)，獲得片段化處理后的產(chǎn)物；

2)將1)所得產(chǎn)物加入cDNA第一鏈合成體系中，反應(yīng)獲得含有cDNA第一鏈的產(chǎn)物，所述cDNA第一鏈合成體系中包括逆轉(zhuǎn)錄引物、TSO引物；其中：

所述逆轉(zhuǎn)錄引物的序列包括：

第一接頭序列和poly(N)區(qū)，N選自ATCG中的任一種，poly(N)區(qū)位于引物3’端；

所述TSO引物的序列包括：

第二接頭序列和poly(G)區(qū)，poly(G)區(qū)位于引物3’端；

3)將2)所得產(chǎn)物加入第一輪PCR體系中，擴(kuò)增獲得第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述第一輪PCR體系中，采用的擴(kuò)增引物包括如下引物組：

引物組一：引物1、引物2，

其中，引物1的序列包括：TSO引物的第二接頭序列；引物2的序列包括：逆轉(zhuǎn)錄引物的第一接頭序列；

4)將3)所得第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二輪多重PCR擴(kuò)增，獲得融合基因檢測(cè)文庫；其中，所述第二輪多重PCR擴(kuò)增中，采用的擴(kuò)增引物包括如下引物組：

引物組二：引物3、引物4、特異性引物，

其中，引物3的序列包括：測(cè)序通用接頭序列-TSO引物的第二接頭序列；

引物4的序列包括：測(cè)序通用接頭序列-第三接頭序列；

特異性引物的序列包括：第三接頭序列，其中第三接頭序列位于引物5’端。

2.如權(quán)利要求1所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述引物1、引物2、引物3、引物4的序列如表1所示。

3.如權(quán)利要求1所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟1)中，在94℃條件下片段化處理4分鐘獲得片段化處理后的RNA。

4.如權(quán)利要求1所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟1)中，獲得片段化處理后的RNA長(zhǎng)度為250-350bp。

5.如權(quán)利要求1所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述特異性引物的序列為表1中ALK_19_GSP，ALK_20_GSP，ROS1_32_GSP，ROS1_34_GSP，ROS1_35_GSP，ROS1_36_GSP，RET_8_GSP，RET_11_GSP，RET_12_GSP，NTRK3-14-GSP，NTRK3-15-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK1-9-GSP，NTRK1-10-GSP中的一種或多種。

6.如權(quán)利要求1所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟4)中，所述第一輪多重PCR的擴(kuò)增條件為：

7.一種高靈敏度融合基因的非疾病診斷治療目的檢測(cè)方法，其特征在于，將如權(quán)利要求1所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫用于高通量測(cè)序，獲得高靈敏度融合基因檢測(cè)結(jié)果。

8.一種高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括表1中ALK_19_GSP，ALK_20_GSP，ROS1_32_GSP，ROS1_34_GSP，ROS1_35_GSP，ROS1_36_GSP，RET_8_GSP，RET_11_GSP，RET_12_GSP，NTRK3-14-GSP，NTRK3-15-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK1-9-GSP，NTRK1-10-GSP中的一種或多種；以及引物1、引物2、引物3、引物4。

9.如權(quán)利要求8所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建試劑盒，其特征在于，所述高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建試劑盒還包括第一緩沖體系、第一鏈合成體系。

10.一種如權(quán)利要求1所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建方法或如權(quán)利要求7所述的高靈敏度融合基因的非疾病診斷治療目的檢測(cè)方法、或如權(quán)利要求9所述的高靈敏度融合基因檢測(cè)文庫構(gòu)建試劑盒在高靈敏度融合基因檢測(cè)中的應(yīng)用。