[發(fā)明專利]耐高溫D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶、突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911384895.2
• 申請日: 2019-12-28
• 公開（公告）號: CN110904088B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 柳志強(qiáng);賈東旭;鄭裕國;孫晨奕;金利群;彭晨;陳德水;廖承軍;程新平;李勉;毛寶興
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12P19/24;C12P19/02
• 代理公司: 浙江千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發(fā)明涉及一種新型耐高溫D?阿洛酮糖3?差向異構(gòu)酶及突變體，及其在微生物催化D?果糖異構(gòu)化制備D?阿洛酮糖(D?psicose)中的應(yīng)用。所屬異構(gòu)酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述異構(gòu)酶突變體由SEQ ID NO.3所示氨基酸經(jīng)定點(diǎn)突變而得，所述點(diǎn)突變位點(diǎn)為下列中的一個或多個：(1)第106位、(2)第183位、(3)第211位、(4)第276位。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一種全新的耐高溫D?阿洛酮糖3?差向異構(gòu)酶突變體，該突變體具有超高酶活和底物轉(zhuǎn)化率，最適反應(yīng)溫度可達(dá)90℃。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00g/L，反應(yīng)溫度為85℃時，產(chǎn)物得率最高達(dá)67.14％。將重組酶進(jìn)行固定化并連續(xù)催化300批次，轉(zhuǎn)化率均大于67％。本發(fā)明解決了現(xiàn)有酶催化制備D?psicose效率低下的難題，獲得的優(yōu)于文獻(xiàn)報道的連續(xù)轉(zhuǎn)化效果對提升D?psicose工業(yè)化水平具有重要意義。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種耐高溫D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶及其突變體，及其在微生物催化D-果糖異構(gòu)化制備D-阿洛酮糖中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

D-阿洛酮糖(D-psicose)是D-果糖的C-3差向異構(gòu)體，屬于稀有糖家族，因其高甜度低能量，是一種理想的蔗糖替代物。D-psicose通過競爭吸收和排泄轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白，可以抑制D-果糖和D-葡萄糖的吸收，進(jìn)而減少體內(nèi)脂肪累積，降低糖尿病風(fēng)險。長期和短期的D-psicose膳食補(bǔ)充，對II型糖尿病患者和胰島β-細(xì)胞功能缺陷患者細(xì)胞均有明顯的益處。D-psicose在自然界中含量稀少，僅在部分植物(如小麥和鼠刺屬植物)中有發(fā)現(xiàn)，直接提取導(dǎo)致資源浪費(fèi)和環(huán)境破壞。采用化學(xué)合成法，催化反應(yīng)復(fù)雜，純化過程繁瑣，化學(xué)污染嚴(yán)重。因此，需要采用更加高效的合成方式制備D-psicose。

生物轉(zhuǎn)化是一種利用微生物產(chǎn)生的一種或幾種特殊的胞外或胞內(nèi)酶作為生物催化劑，將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的過程。生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和、原料利用率高的特點(diǎn)，同時轉(zhuǎn)化過程具有優(yōu)良的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性，能夠保證目標(biāo)化合物的高效合成。目前，利用異構(gòu)酶或含有該酶的細(xì)胞為生物催化劑進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)制備多種糖類化合物，已成為制糖工業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)。

D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose3-epimerase，簡稱DPE)屬于酮糖3-差向異構(gòu)酶家族，用于催化D-果糖異構(gòu)化生成D-psicose。當(dāng)前的D-psicose生產(chǎn)技術(shù)主要集中在日本稀有糖研究中心、首爾國立大學(xué)等機(jī)構(gòu)，所用的DPE主要來源于Agrobacteriumtumefaciens ATCC33970、Clostridium cellulolyticum H10和Rhodobacter sphaeroidesSK011等野生菌(Kim T et al.，PLoS ONE,2016,11(7):e0160044.)。上述DPE均不屬于耐熱性酶，只能在50～60℃的異構(gòu)化溫度下進(jìn)行催化反應(yīng)，D-果糖轉(zhuǎn)化率介于25～35％之間。

有報道指出，DPE介入的D-果糖異構(gòu)化過程是一個熱力學(xué)平衡反應(yīng)，隨著異構(gòu)化溫度的升高，會促進(jìn)異構(gòu)化反應(yīng)向D-psicose方向進(jìn)行。如果能在高溫如70℃或更高的異構(gòu)化溫度下催化，促使平衡正向進(jìn)行，提高D-果糖轉(zhuǎn)化率，獲得高濃度產(chǎn)物，將大幅度減小生產(chǎn)、提取等成本。目前，用于合成的D-psicose的DPE酶源較少，工業(yè)化水平有待提高。

由于異構(gòu)酶本身作用環(huán)境和對象的多樣化，通常具備底物譜廣泛的優(yōu)勢，可以由一種異構(gòu)酶催化制備多種糖產(chǎn)品。酶的分子改造能通過分子手段極大限度地提高天然酶的催化效率，是改造天然酶的重要手段。本發(fā)明通過探索異構(gòu)酶的底物譜，開發(fā)異構(gòu)酶的新功能，將分子改造獲得的高效生物催化劑用于制備高濃度D-psicose，對于滿足人民群眾日益增長的攝糖需求具有重要意義。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種耐高溫D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶及突變體，及其在微生物催化D-果糖異構(gòu)化制備D-阿洛酮糖中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：