[發明專利]一種具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白及其表達方法

有效

• 申請號: 201911384531.4
• 申請日: 2019-12-28
• 公開（公告）號: CN111087464B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 徐蘭舉;齊磊;劉鑫;申翠美;杜亞東
• 申請（專利權）人: 河北納科生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/66;C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊德皓專利代理事務所(普通合伙) 13129
• 代理人: 劉磊娜

本發明涉及一種具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白及其原核表達方法，所述的人源III型膠原蛋白的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示，通過與基因序列為SEQ ID NO:4的羥化酶Hy726共同表達，得到具有三級螺旋結構的重組人源III型膠原蛋白，該蛋白具有更好的穩定性和功能性，更能媲美天然人源III型膠原蛋白生物活性。

技術領域

本發明屬于優化編碼基因技術領域，具體地涉及一種具有功能結構重組人源III型膠原蛋白及其原核表達方法。

背景技術

體膠原蛋白又稱膠原，是一種糖蛋白，III型膠原蛋白由三條肽鏈向右卷曲扭成的三股螺旋狀。一級結構分析表明，其多肽鏈很長的區段序列是由GLy-x-y氨基酸序列重復而成。其中，x通常為脯氨酸，y通常為羥脯氨酸和羥賴氨酸，這種三肽重復序列對膠原蛋白的結構起著很大的作用，特別是成纖維膠原的膠原域是由長而不中斷的三股螺旋組成。羥脯氨酸和羥賴氨酸在其他蛋白質中很少見，羥脯氨酸羥基能參與鏈間的氫鍵形成，促進三螺旋結構的形成，提高膠原蛋白的穩定性和功能性，對穩定膠原蛋白三螺旋結構并保證其在體溫下的熱穩定性至關重要。

膠原蛋白現已被廣泛應用于化妝品、醫療器械等領域，用于實現對組織的修復、再生。膠原蛋白的三股螺旋結構對于其實現組織修復功能起著至關重要的作用，同時三股螺旋結構的膠原蛋白比單鏈的多肽序列要穩定。傳統的膠原蛋白主要通過提取的方式從動物組織中獲得。然而，動物組織中提取的膠原蛋白存在感染瘋牛病等傳染性病毒的風險。

現有技術中，雖然對III型人源膠原蛋白的重組技術進行了一些報道，例如CN110194795A公開了一種重組人源膠原蛋白及其應用，選取了人源三型蛋白保守區域的一段序列并將其重復8次，將設計得到的序列重組構建原核表達載體pET22b中，經過誘導表達，最終得到了能夠在大腸桿菌中高效表達的，可溶于水的重組人源膠原蛋白。CN103122027A公開了一種重組人源膠原蛋白及其生產方法，結構為單鏈結構，基本重復單元為gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，為人膠原蛋白III型肽段，末端序列為GPPGPCCGGG，為人膠原蛋白II型肽段。尚未有對于重組人源膠原蛋白的功能性三維螺旋結構的技術報道。

有鑒于此，發明一種具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白的表達方法尤為重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠提高穩定性的具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白，并同時提供其高效的原核表達方法。

為實現上述目的，本發明所采取的技術方案是：

本發明一方面提供了一種具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白，其具有三級結構，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示。

本發明還提供了一種參與上述膠原蛋白表達的羥化酶Hy726基因，其核苷酸序列為為SEQ ID NO:4所示。

本發明還提供了一種包含所述人源III型膠原蛋白的編碼基因和羥化酶Hy726基因的重組表達載體pACYCDuet 1-Hy726-1230。

本發明還提供了一種含有所述重組表達載體pACYCDuet 1-Hy726-1230的重組基因工程菌，所述重組基因工程菌的宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明最后一方面提供了一種所述具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白原核表達方法，具體包括如下步驟：

（1）基因設計和合成

依據人源III型膠原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:1和巨型病毒 4-脯氨酸羥化酶氨基酸序列SEQ ID NO:2，反向設計基因序列，進行密碼子優化，得到人源III型膠原蛋白的編碼基因序列SEQ ID NO:3和羥化酶Hy726基因序列SEQ ID NO:4，進而根據SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示基因序列，分別進行全基因合成；