[發明專利]一種具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白及其表達方法

有效

• 申請號: 201911384531.4
• 申請日: 2019-12-28
• 公開（公告）號: CN111087464B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 徐蘭舉;齊磊;劉鑫;申翠美;杜亞東
• 申請（專利權）人: 河北納科生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/66;C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊德皓專利代理事務所(普通合伙) 13129
• 代理人: 劉磊娜

1.一種包含如核苷酸序列SEQ ID NO:3的人源III型膠原蛋白的編碼基因和如核苷酸序列SEQ ID NO:4所示的羥化酶Hy726基因的重組表達載體pACYCDuet 1-Hy726-1230。

2.一種含有如權利要求1所述重組表達載體pACYCDuet 1-Hy726-1230的重組基因工程菌，其特征在于，所述重組基因工程菌的宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

3.一種氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示的具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白原核表達方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

（1）基因設計和合成

依據人源III型膠原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:1和巨型病毒 4-脯氨酸羥化酶氨基酸序列SEQ ID NO:2，反向設計基因序列，進行密碼子優化，得到人源III型膠原蛋白的編碼基因序列SEQ ID NO:3和羥化酶Hy726基因序列SEQ ID NO:4，進而根據SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示基因序列，分別進行全基因合成；

（2）重組表達載體pACYCDuet 1-Hy726-1230的構建：

a）將所述人源III型膠原蛋白的編碼基因SEQ ID NO:3插入到表達載體pET30a(+) 的酶切位點NdeI和XhoI之間，通過熱激方法轉化到宿主菌E.coli DH5α中，挑取陽性克隆，采用質粒快速提取試劑盒提取質粒，得到重組表達載體pET30-1230；

b）以合成的羥化酶Hy726的原核表達載體pUC-Hy726作為模版，利用高保真PCR技術擴增克隆Hy726片段，PCR產物純化后以Nco I和BamH I雙酶切，得到片段Hy726(N-B)，Nco I和BamH I雙酶切pACYCDeut 1空載體，得到片段pACYCDuet 1(N-B)，連接Hy726(N-B)和pACYCDuet 1(N-B) ，連接物轉化入感受態細菌，提取質粒，得到載體pACYCDeut 1-Hy762；

c）將重組表達載體pET30-1230和載體pACYCDeut 1-Hy762分別以Nde I 和Xho I雙酶切，得到外源片段1230(N-X)和載體骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X)，連接體系轉化DH5α感受態細菌，提取得到重組質粒pACYCDuet 1-Hy726-1230；

（3）轉化體BL21(DE3) / pACYCDuet 1-Hy726-1230的構建

將重組表達載體pACYCDuet 1-Hy726-1230通過熱激轉化入感受態細胞BL21(DE3)，篩選獲得重組基因工程菌；

（4）誘導表達

將獲得的重組基因工程菌接入M9培養基中，37℃培養過夜，再以2%的接種量接種到M9培養基中，23℃培養14h，加入終濃度為0.05mM IPTG進行誘導表達，繼續培養12h，離心收集菌體。

4.根據權利要求3所述的具有功能結構的重組人源III型膠原蛋白原核表達方法，其特征在于，還包括步驟（5）蛋白純化：使用磁珠對重組蛋白進行純化。