[發明專利]一種重組人源III型膠原蛋白及其原核表達方法

有效

• 申請號: 201911384510.2
• 申請日: 2019-12-28
• 公開（公告）號: CN111087463B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 徐蘭舉;齊磊;劉鑫;申翠美;杜亞東
• 申請（專利權）人: 河北納科生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊德皓專利代理事務所(普通合伙) 13129
• 代理人: 劉磊娜

本發明涉及一種重組人源III型膠原蛋白及其原核表達方法，所述的人源III型膠原蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示，編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示，通過進行密碼子優化和設計得到基因序列，所述基因序列插入到表達載體PET30a（+）的酶切位點NdeI和XhoI之間構建重組表達載體pET30?1230，轉化大腸桿菌BL211(DE3)感受態細胞，挑取陽性克隆，培養誘導進行高效表達。

技術領域

本發明屬于優化編碼基因技術領域，具體地涉及一種重組人源III型膠原蛋白及其原核表達方法。

背景技術

膠原蛋白，是一種糖蛋白，根據組織部位、生理功能、分子結構不同而分為28種以上膠原蛋白，占比最多研究最透徹的為I型、II型和III型膠原蛋白。人體皮膚內膠原蛋白為I 型膠原和 III 型膠原，I型膠原主要存在于成人皮膚、 肌腱、骨組織，Ⅲ型膠原主要存在于嬰兒皮膚或血管內膜、腸道，I 型膠原和 III 型膠原與皮膚損傷修復過程和修復質量緊密相關。其中， III型膠原蛋白由三條肽鏈向右卷曲扭成的三股螺旋狀，具有優秀的生物學活性和組織相容性，能促使真皮層成纖維母細胞增生，提高細胞活性，并被成纖維細胞作為合成膠原蛋白的原料吸收，刺激細胞更多的合成膠原蛋白、使受損老化的皮膚得到填充和修復，重建網狀結構，增強受損皮膚的擴張力，恢復皮膚彈性。

天然膠原蛋白的結構復雜，并且無法溶于水，這些特性限制了天然膠原蛋白的研發、利用和生產。目前市場上銷售的膠原蛋白產品都是取自豬、牛和魚等動物組織，進而通過酸、堿、酶解法處理得到，其生物學活性遠遠不及人體天然膠原蛋白，不能滿足醫藥、食品和化妝品等行業需求。隨著DNA重組技術的迅速發展，現有技術中對于III型人源膠原蛋白的重組技術報道如下：CN110194795A公開了一種重組人源膠原蛋白及其應用，選取了人源三型蛋白保守區域的一段序列并將其重復8次，將設計得到的序列重組構建原核表達載體pET22b中，經過誘導表達，最終得到了能夠在大腸桿菌中高效表達的，可溶于水的重組人源膠原蛋白。CN103122027A公開了一種重組人源膠原蛋白及其生產方法，結構為單鏈結構，基本重復單元為gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，為人膠原蛋白III型肽段，末端序列為GPPGPCCGGG，為人膠原蛋白II型肽段。以上存在如下缺陷：上述專利選取了一段很短的片段作為重復單元，拼接在一起來表達為長片段的重組人源膠原蛋白，不能夠很好的復制人源膠原蛋白的序列。

發明內容

本發明的目的在于提供一種生物活性高、水溶性好的重組人源III型膠原蛋白，同時提高其原核表達效率。

為實現上述目的，本發明所采取的技術方案是：

本發明一方面提供了一種重組人源III型膠原蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示。

本發明另一方面提供了所述人源III型膠原蛋白的編碼基因的核苷酸序列為SEQID NO:2所示。

本發明再一方面提供了包含所述人源III型膠原蛋白的編碼基因的重組表達質粒pET30-1230。

在本發明的一些實施方案中，所述人源III型膠原蛋白的編碼基因插入到表達載體PET30a（+）的酶切位點NdeI和XhoI之間。

本發明又一方面提供了含有所述重組表達質粒pET30-1230的重組基因工程菌，所述重組基因工程菌的宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明最后一方面提供了所述人源III型膠原蛋白原核表達方法，具體包括如下步驟:

（1）基因設計和合成：依據人源III型膠原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:1，反向設計基因序列，進行密碼子優化，得到基因序列SEQ ID NO:2，進而根據SEQ ID NO:2所示基因序列，進行全基因合成；