[發(fā)明專利]一種重組人源III型膠原蛋白及其原核表達(dá)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911384510.2
• 申請(qǐng)日: 2019-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111087463B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐蘭舉;齊磊;劉鑫;申翠美;杜亞?wèn)|
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北納科生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/78
• 分類號(hào): C07K14/78;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊德皓專利代理事務(wù)所(普通合伙) 13129
• 代理人: 劉磊娜

1.一種重組人源III型膠原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的人源III型膠原蛋白的編碼基因，其特征在于，該編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示。

3.一種包含如權(quán)利要求2所述的人源III型膠原蛋白的編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET30-1230。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)質(zhì)粒pET30-1230，其特征在于，所述人源III型膠原蛋白的編碼基因插入到表達(dá)載體PET30a（+）的酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI之間。

5.一種含有權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體pET30-1230的重組基因工程菌，其特征在于，所述重組基因工程菌的宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

6.一種如權(quán)利要求1所述人源III型膠原蛋白原核表達(dá)方法，其特征在于，具體包括如下步驟:

（1）基因設(shè)計(jì)和合成：依據(jù)人源III型膠原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:1，反向設(shè)計(jì)基因序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到基因序列SEQ ID NO:2，進(jìn)而根據(jù)SEQ ID NO:2所示基因序列，進(jìn)行全基因合成；

（2）重組表達(dá)載體pET30-1230的構(gòu)建：將所述人源III型膠原蛋白的編碼基因SEQ IDNO:2插入到表達(dá)載體pET30a(+)的酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI之間，通過(guò)熱激方法轉(zhuǎn)化到宿主菌E .coli DH5α中，挑取陽(yáng)性克隆，采用質(zhì)粒快速提取試劑盒提取質(zhì)粒，得到重組表達(dá)載體pET30-1230；

（3）轉(zhuǎn)化體BL21(DE3) / pET30-1230的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒pET30-1230通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，篩選獲得重組基因工程菌；

（4）誘導(dǎo)表達(dá)：將獲得的重組基因工程菌接入M9培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，再以2%的接種量接種到M9培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)14h，加入終濃度為0.05mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)12h，離心收集菌體。