[發(fā)明專利]一種IV型膠原蛋白的檢測試劑盒及其制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201911384289.0 | 申請日： | 2019-12-28 |
| 公開（公告）號： | CN111157740B | 公開（公告）日： | 2023-08-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王賢俊;鄭蓓蕾 | 申請（專利權(quán)）人： | 王賢俊 |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/531 |
| 代理公司： | 溫州名創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33258 | 代理人： | 陳加利 |
| 地址： | 325000 浙江省*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 iv 膠原 蛋白 檢測 試劑盒 及其 制備 方法 | ||
1.一種IV型膠原蛋白的檢測試劑盒，包括有試劑R1和試劑R2，其特征在于：所述的試劑R1與試劑R2的體積比為3:1；
所述的試劑R1包括以下組分：
pH6.0-6.5的醋酸鹽緩沖液?????????????50mmol/L
牛血清白蛋白????????????????????????0.9g/L
疊氮鈉??????????????????????????????0.01%
所述的試劑R2包括以下組分：
pH6.0-6.5的醋酸鹽緩沖液?????????????50mmol/L
Ⅳ型膠原蛋白抗體膠乳顆粒????????????20ml/L
Triton?X-100????????????????????????8ml/L
甘氨酰胺鹽酸鹽??????????????????????13g/L
聚乙二醇8000????????????????????????25g/L
疊氮鈉??????????????????????????????0.01%
所述的Ⅳ型膠原蛋白抗體膠乳顆粒為通過組合型偶聯(lián)劑，將Ⅳ型膠原蛋白抗體交聯(lián)于羧基膠乳微球上，形成Ⅳ型膠原蛋白抗體膠乳顆粒；
所述的組合型偶聯(lián)劑包括有以下組分：
碳二亞胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽三者質(zhì)量比為1.2﹕1.2﹕1；
所述檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟：
（1）Ⅳ型膠原蛋白抗體膠乳顆粒的制備，包括以下子步驟
（1.1）用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸鹽緩沖液懸浮10%w/v且粒徑100-200nm羧基膠乳微球，室溫攪拌30min混合均勻，10000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，去除上清液后用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸鹽緩沖液重懸浮，室溫攪拌30min混合均勻，使其質(zhì)量體積濃度為2%；
（1.2）取上述懸浮微球，邊室溫攪拌，邊加入組合偶聯(lián)劑；該組合偶聯(lián)劑的成分為碳二亞胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽；
其對應質(zhì)量比例為微球溶液﹕碳二亞胺﹕O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸﹕O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽=10﹕1.2﹕1.2﹕1；
O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽在加入前分別用1%醋酸溶液37℃超聲10min溶解完全；
加入順序為先加入碳二亞胺室溫攪拌20min，再同時加入含O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的醋酸溶液與含O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽的醋酸溶液，室溫攪拌30min；
（1.3）用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸鹽緩沖液溶解鼠抗人Ⅳ型膠原蛋白單克隆抗體，使其濃度為5mg/ml；
（1.4）邊攪拌邊快速將上述溶解后的抗體按照體積比抗體﹕膠乳微球=1﹕5加入到經(jīng)過處理的膠乳微球中，室溫持續(xù)攪拌30min后，調(diào)pH至6.5，室溫孵育3h；
（1.5）孵育完成后在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，去除上清液，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸鹽緩沖液洗滌，再次10000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，重復6次，完成最后一次離心，去上清液后用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸鹽緩沖液重懸浮，室溫攪拌1h混合均勻，使其質(zhì)量體積濃度為1%；
（1.6）加入3%質(zhì)量體積濃度的牛血清白蛋白室溫持續(xù)攪拌30min，靜置封閉24h；
（1.7）時間到后，將封閉好的膠乳微球在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，去除上清液，用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸鹽緩沖液洗滌，再次在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，重復2次，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸鹽緩沖液重懸浮，室溫攪拌1h混合均勻，得到質(zhì)量體積濃度為1%的Ⅳ型膠原蛋白抗體膠乳顆粒；
（2）按照試劑R1和試劑R2的組分比例配置雙試劑。
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